11644 (685002), страница 2
Текст из файла (страница 2)
В условиях, при которых ДСН и тритон Х-100 полностью, а бридж-58 частично растворяют клеточную стенку E.coli, лаурилсаркозилат вызывает избирательную диссоциацию цитоплазматической мембраны (ЦПМ). Наличие ионов магния при обработке клеточных стенок препятствует растворению цитоплазматической фракции лаурилсаркозилатом. Тритон Х-100 в этих условиях растворял только ЦПМ и не действовал на наружную мембрану.
Изучено влияние солей KCl, NaCl, NH4Cl, (NH4)2SO4 на антимикробную активность неионных ПАВ, в частности по отношению к стафилококкам. Механизм действия одновалентных катионов в это случае связан с воздействием ПАВ на клеточную стенку способностью конкурировать с антимикробными агентами. Установлено, что мутант стафилококков, дефектный по липолисахаридам, имеет повышенную чувствительность к дезоксихолату и таким КПАВ, как гексадецилпиридинхлорид, бензаммонийхлорид. Присутствие большого количества липополисахаридов и белков с фосфолипидом на внешней мембране являются решающим фактором, который определяет устойчивость грамотрицательных микроорганизмов к детергентам. В отношении устойчивости к ПАВ бактерий-деструкторов, например псевдомонад к ДСН, полагают, что большая устойчивость штамма-деструктора по сравению с мутантным штаммом (не способным разрушать ДСН) обусловлена не столько наличием специфических ферментов, разрушающих ПАВ, сколько особенностями биохимического состава клеточной стенки /5/.
Ряд авторов /12/ отмечают также, что «молодые» бактериальные клетки, выращенные на полноценной питательной среде, Устойчивее к действию ДСН, чем клетки более поздней фазы роста. Существенное значение также заряд клеточной поверхности. При щелочном значении рН на поверхности клетки уменьшается число положительно заряженных групп, в соответствии с этим снижается и количество сорбированного на поверхности ПАВ за счет электростатического притяжения гидрофильной части молекулы ДСН, несущей отрицательный заряд. Вследствие этого количество ПАВ на поверхности обусловлено теми гидрофобными участками, с которыми взаимодействует алкильная часть молекулы ДСН. Таким образом, ПАВ способны взаимодействовать с различными компонентами клеточных стенок бактерий, включая муреиновый слой, белки, липиды, липопротеины, липолисахариды. Проникновение ПАВ внутрь клеток, если оно затруднено пространственными или электростатическими факторами, может происходить и через поры. Существенную роль в устойчивости микроорганизмов к действию детергентов играет «электростатическое экранирование», обусловленное наличием заряженных функциональных групп на поверхности их клеток, а также присутствием ионов металлов в среде /5/.
Рассмотрим общую характеристику мембран. На электронных микрофотографиях ультратонких срезов клеток бактериальная клеточная мембрана выглядит как двойная линия шириной около 8 нм. Она состоит из двух слоев фосфолипидов, в которые включены мембранные белки. Самой перспективной и наиболее убедительно трактующей современные экспериментальные данные считается метаморфно-жидкостно-мозаичная модель структуры мембраны. С ее помощью объясняется и присутствие в мембранах белков двух типов: периферических и интегральных. Первые переходят в надосадочную жидкость при отмывании мембран буферными растворами с различными значениями рН или ионной силы. Вторые – внутренние белки, сохраняющие связь с мембранами после проведения перечисленных операций и освобождающиеся только после разрушения фосфолипидного бислоя. Следует отметить, что обычно интегральные белки имеют амфифильную природу и способны к самоагрегации в водных растворах. Большая часть мембранных белков бактерий является белками-переносчиками и ферментами, ответственными за биосинтез макромолекул. В настоящее время известно около 20 различных белков бактериальных внешних мембран, некоторые из них синтезируются в больших количествах. ПАВ является уникальным инструментом для для извлечения белков из бактериальных мембран /12/.
Принципиальное сходство в действии НПАВ и АПАВ свидетельствует о том, что главным агентом фрагментациимембраны являются не заряженные гидрофильные группы детергента, а гидрофобная часть молекулы. Отсюда следует, что мицелла, соприкоснувшись с поверхностью мембраны, вероятно, изменяет свою конфигурацию, обнажая гидрофобные группы. В такой форме ПАВ взаимодействует с мембраной, главным образом за счет неполярной гидрофобной части молекул, что, по-видимому, сопровождается солюбилизацией ПАВ в гидрофобных участках мембраны. При этом последняя дробится на более или менее крупные липопротеидные фрагменты, солюбилизированные благодаря присутствию в них ПАВ /13/.
Связывание детергента с мембраной зависит от числа связывающих мест и от степени их сродства к молекулам детергента. Число мест связывания при высоком уровне сродства невелико, что, в свою очередь, слабо влияет на конформацию мембранных белков. С увеличением концентрации детергента постепенно начинают насыщать места связывания с высоким сродством к детергенту. Этим объясняется «мягкое» воздействие НПАВ на мембраны, так как значения их концентрации мицеллообразования (ККМ) ниже, чем в случае АПАВ. При изучении последовательности действий КПАВ на цитоплазматические мембраны стрептококков установлено, что в первую очередь изменяется проницаемость мембран. Этим обусловлено нарушение тех функций мембран, которые зависят от их нативной проницаемости – транспорта веществ и преобразования энергии. Действие более высоких концентраций КПАВ сопровождается солюбилизацией белковых и липидных компонентов мембран, изменением вторичной структуры белков и инактивацией их ферментных систем. Нарушение проницаемости мембран стрептококков под влиянием катионных детергентов определяется действием этих соединений на липидные компоненты мембран, что приводит к изменению структурной организации их гидрофобной области /14/.
Установлено, что КПАВ действуют на фосфолипидные компоненты мембран протопластов у стрептококков, лизис которых является результатом вторичных осмотических явлений. АПАВ, наоборот, воздействует на белковые компоненты мембран. В результате ингибирования лизиса протопластов после предварительной обработки последних ионами уранила подтверждена важная роль фосфатных групп в механизме действия ПАВ на мембрану. Предполагается, что АПАВ и КПАВ действуют на различные участки мембраны или на один и тот же участок, но различными путями. В ряду алкилсульфатов натрия ДСН обладает наибольшей литической активностью по отношению к ЦПМ протопластов дрожжей. Ряд специалистов полагают, что сорбция ионов ПАВ происходит главным образом на мембранных компонентах липидной природы, а взаимодействие с участием белковых компонентов мембраны /15/.
Советский ученый В.А. Тукмачев предложил модель действия ПАВ на мембраны, согласно которой иго ион (или молекула) сорбируется на мембране, внедряясь в нее своей липофильной частью, и действует на мембранное окружение по принципу клина. При сорбции на мембране определенного количества ионов (или молекул) ПАВ прочность мембраны резко падает, в результате чего она разрушается. Взаимодействие гидрофильных групп с мембранным окружением в этой модели не учитывается. Предполагается, что в литическом процессе это взаимодействие играет второстепенную роль. Е. Фриз (Швеция) предложил следующий механизм взаимодействия ПАВ и мембраны /8/.
1. Связывание детергента без интеграции. При низких концентрациях молекулы ПАВ связываются с мембраной, вероятно, в результате вторжения во внешний слой липидного бислоя.
2. Лизис. Как только концентрация свободного мономера ПАВ достигает определенного уровня, присутствующие молекулы ПАВ дестабилизируют мембрану.
3. Диссоциация мембраны в раствор. При высокой концентрации раствора вся мембрана оказывается окруженной молекулами ПАВ, и дальнейшее их добавление приводит к смене фаз: мембраны перестраиваются в смешанные мицеллы, содержащие детергент-липидные или детергент-белковые комплексы.
4. Освобождение белков от липидов. С увеличением концентрации добавляемого ПАВ количество липидов уменьшается до тех пор, пока все белки не освободятся от них. Экспериментальное подтверждение выдвинутой гипотезы в отношении механизма действия ПАВ было получено при изучении влияния дезоксихолата натрия (ДОХ) на вирус леса Семлики. Так, при концентрации ПАВ 1,5 мМ наблюдалось разрушение вируса и одновременное высвобождение липидов и белков; при 2 мМ ДОХ все мембранные белки освобождались от липидов и образовывали комплексы больших размеров. Увеличение содержания детергента до 5 мМ приводило к возрастанию размеров безлипидных белковых комплексов. Аналогичные результаты получены при действии на этот объект тритона Х-100 и ДСН; различными были лишь концентрации ПАВ, приводившие к одинаковому эффекту.
Причины, по которым до сих пор нет общепринятой схемы механизма действия ПАВ, известны – это отсутствие точных данных о строении и составе бактериальных мембран, а также помехи, которые возникают в результате влияния химических реагентов, присутствующих в среде выращивания. Однако в настоящее время на основе достаточно обширной научной информации можно предположить следующую модель действия ПАВ на мембраны микроорганизмов. Сначала происходит адсорбция молекул ПАВ на поверхности мембраны, изменяя ее проницаемость с последующим нарушением целого ряды функций. Затем при достижении ККМ начинается солюбилизация одного из амфифильных компонентов мембраны белка или липида в зависимости от их локализации и типа детергента. В результате солюбилизации нарушается структурная организация гидрофобных областей мембраны, ответственных за ее целостность. В свою очередь, нарушения такого рода приводят к дезинтеграции мембраны, распаду ее на фрагменты и образованию смешанных мицелл, состоящих из молекул ПАВ и мембранных амфифилов /14/.
В связи с тем, что исследование лизиса мембран под действием ПАВ является одним из активно развивающихся подходов в изучении ее структурной организации, можно ожидать новых, более точных и информативных моделей взаимодействия детергентов с биомембранами.
Другим не менее важным аспектом действия ПАВ на микроорганизмы является их влияние на процессы обмена веществ. За нарушением целостности клеточных структур в результате взаимодействия с детергентами должны последовать изменения на таких ключевых участках микробного обмена веществ, как транспорт и биосинтез молекул, реакция окислительного фосфолирования, фотосинтез /16/.
При изучении влияния твинов на изменение активности накопления -кетоглутаровой кислоты бактериями псевдомонадами установлено, что твины 60 и 80 заметно увеличивают накопление -кетоглутарата. Показано, что твин 80 при 0,6%-й концентрации совместно с добавками изолейцина, метионина, серина, лизина, инозита, аспарата усиливает биосинтез витамина В12 и не влияет на биогенез пропионовой кислоты при выращивании пропионовокислых бактерий на основной питательной среде, содержащей молочную сыворотку. При добавлении в питательную среду плесневелого гриба аспергилла твинов 40, 60 и 80 биомасса последнего увеличивалась в 2,5 раза, что сопровождалось накоплением алкалоидов. Максимальное (100%-ое) увеличение накопления алкалоидов наблюдалась при добавлении твина 80 0,5 – ой концентрации. В присутствии этого детергента скорость поглощения питательных веществ из среды возрастала на 27–50%. Полагают, что твин 80 непосредственно не участвует в биосинтезе алкалоидов, а действует как ПАВ, облегчает транспорт питательных веществ в клетку. Скорость образования фумаровой кислоты и ее выход в культуре гриба ризопус в присутствии твина 60 увеличивается на 43%, а при твине 40 и 60 – на 18%. При смеси двух видов твина эффект зависит от количественного состояния индивидуальных твинов /17/.
Обработка изолированных гетероцист цианобактерий катионным детергентом цетилметиламмонийбромидом повышает их проницаемость для внеклеточных нуклеотидов. Эффектом другого рода, вызванным влиянием детергентов, является изменение скорости потребления кислорода различными микроорганизмами. После обработки клеток сальмонелл лаурилсульфатом натрия значительно понижается дегидрогеназная активность клеток, гликолиз, а также потребление кислорода. Культивирование обработанных детергентом бактерий на среде в присутствии 10% глицерина приводит к восстановлению активности этих процессов. Однако выращивание энтеробактерий, устойчивых к детергентам, на среде с глюкозой и аспарагином в присутствии ДСН (10%) приводит к дополнительным энергозатратам, в результате чего урожай клеток снижается на 20%, а утилизация глюкозы и поглощение кислорода ускоряются соответственно на 30–35 и 60–75% по сравнению с выращиванием на среде без ДСН /18/.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
