11644 (685002), страница 9

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 9)

Синтетические среды с содержанием 1:1 и 1,5:0,5 импортного и отечественного агар-агара обозначили буквами В и С соответственно, а мясопептонный бульон-А. Изменение культуральных свойств в зависимости от вида питательной среды представлено в табл. 3.

Как видно из данных, представленных в табл. 3, с изменением состава синтетической среды (с В на С) колоний практически не изменяется и колеблется от белого до желтоватого. Форма колоний – круглая, но с уменьшением содержания органической примеси у культур I и I’ форма оставалась без изменений, но с валиком по краям и фестончатым краем соответственно. Профиль и поверхность колоний не менялись. У культур I и I’ размеры переходят от точечных до средней величины. А также структура колоний I’ переходит из однородной (среда В) в мелкозернистую (среда С).

На МПА культуры имели, в основном, круглую форму, но с разнообразными краями – гладкими (колонии 3, F, G) и ворсистыми (7, I, I’). Поверхность выросшие культуры имели гладкую, за исключением F, I (шероховатая). Все колонии имели точечные размеры (диаметр менее 1 мм), кроме I (средней величины d>1 мм). Цвет изменяется от белого до желтого. Структура колоний 3,7, G была однородной, а у культур F, I, I’ – мелкозернистой. Из табл. 3 видно, что с изменением соотношения агар-агара импортного и отечественного производства lg КОЕ снижается. Так, например, для культуры 3 данный показатель уменьшается с 7,62 до 6,48. На среде МПА максимальный lg КОЕ наблюдается у культуры 3 (27,82), а минимальный – у I’ (18,04).

Далее определяли такие морфолого-физиологические признаки микроорганизмов, как спорообразование, подвижность, разжижение желатина, наличие сероводорода, аммиака, каталазы, а также редуцирующую способность. Данные определений представлены в табл. 4.

Далее провели исследования колоний на тинкториальную способность (окраска по Граму и подвижность). Окраска по Граму является дифференциально-диагностической и зависит от содержания в клеточной стенке гликолипида муреина, представляющего собой гетерополимер, который в свою очередь состоит из чередующихся остатков N-ацетилглюкозоамина и N – ацетилмурамовой кислоты и пептидов. Грамположительная окраска указывает на наличие небольшого количества полисахаридов, липидов и белков и характерна для всех выделенных культур. Исследование подвижности показало, что для микроорганизмов типа 3,7, I характерен лофотрихиальный тип движения, культуре F – перетрихиальный, G – монотрихиальный. А для культуры I’ характерен как монотрихиальный, так и лофотрихиальный тип движения.

Протеолитические свойства микроорганизмов изучали посевом в мясопептонный желатин (МПЖ) согласно п. 2.2.5. Выделенные культуры, кроме F, обладают протеолитическими свойствами, т. к. разжижают МПЖ. Для обнаружения сероводорода делали посев уколом пристеночно в агар-агар с уксуснокислым свинцом (п. 2.2.5.1.). Если культура при разложении белка выделяет сероводород, то появляется темно-бурое окрашивание (почернение) по месту укола в плотной среде. Культуры 3, F, I выделяют сероводород, а остальные – нет. Ни одна культура не выделяет аммиак, определение которого проводили в соответствии с п. 2.2.5.2. при наличии фермента каталазы при действии перекиси водорода обнаруживают обильное выделение пузырьков отщепленного кислорода, т.е. образуется «пенистая шапка». Каталаза присутствует во всех выделенных культурах. Редуцирующей способностью (обесцвечивание молока с метиленовым синим) обладают все культуры, за исключением I.

На основе исследования свойств микроорганизмов определили их видовую принадлежность /53/. Бактерии рода Listeria представляют собой короткие палочки правильной формы с закругленными краями. Грамположительные, неспорообразующие, каталазоположительные. Следовательно, культуры 3, 7, G, I’ можно отнести к данному роду, т. к. они имели форму коротких палочек, окрасились в фиолетовый цвет (грамположительные) и не образовывали при определении каталазы «пенистую шапку». Данные микроорганизмы широко распространены в окружающей среде, некоторые виды патогенны для человека и животных.

Культуру F можно отнести к роду Brochotrix. Данные микроорганизмы имеют палочки правильной формы в цепочках, грамположительные и каталазоположительные. Эти признаки наблюдались при изучении свойств культуры F. Данные организмы широко распространены в природе.

Бактерии рода Bacillus имеют форму прямых палочек с закругленными концами, грамположительные, подвижные и образующие овальные эндоспоры, каталазоположительные. Как видно из данных табл. 4, все эти признаки относятся к культуре I. Данные микроорганизмы обнаруживаются в разнообразных местообитаниях, некоторые виды патогенны для позвоночных и беспозвоночных.

Липолитические свойства микроорганизмов определяли посевом в бульон Штерна, где в качестве единственного источника углерода использовали оливковое масло с концентрацией 1 см³/100 см³ бульона. Бактерии, обладающие липолитическими свойствами, при ферментации оливкового масла извлекают из него альдегиды, подкисляя среду, при этом окраска бульона переходит из золотисто-желтой в розовую. Стерильный бульон Штерна разливали в пробирки по 10 см³ в каждую и вносили исследуемые культуры. Пробирки с микроорганизмами термостатировали при температуре (380,5)⁰С. В течение 120 ч проводили визуальные наблюдения за изменением физических свойств бульона Штерна, которые выражались в образовании хлопьев, а также в изменении цвета и прозрачности. В качестве контрольного варианта использовали состав, включающий в себя бульон Штерна без введения микроорганизмов. Результаты наблюдений представлены в табл. 5.

Таблица 5. Влияние типов бактерий на свойства бульона Штерна

Тип колоний	Показатели качественного состояния бульона	Характеристика изменения качественного состояния бульона через
(род)	Штерна	0 ч	24 ч	48 ч	72 ч	96 ч	120 ч
Контрольный вариант	Цвет бульона	золот-желт	золот-желт	золот-желт	золот-желт	золот-желт	золот-желт
	Наличие хлопков	-	-	-	-	-	-
	Ширина жирового кольца, мм	2,0	1,5	1,5	1,5	1,5	1,5
	Наличие помутнения	-	-	-	-	-	-
	рН	6,5	6,5	6,5	6,5	6,5	6,5
Listeria	Цвет бульона	золот-желт	золот-желт	золот-желт	золот-желт	с роз. оттенком	розовый
sp I	Наличие хлопков	-	-	-	-	-	-
	Ширина жирового кольца, мм	2,0	2,0	2,0	2,0	2,0 част разрушение кольца	2,0 част разруш-ие кольца
	Наличие помутнения	-	+/-	+/-	+/-	+/-	+/-
	рН	6,5	6,5	6,0	5,5	5,5	5,5
Listeria	Цвет бульона	золот-желт	золот-желт	золот-желт	золот-желт	золот-желт	золот-желт
sp 3	Наличие хлопков	-	-	-	-	-	-
	Ширина жирового кольца, мм	2,0	2,0	2,0	2,0	2,0	2,0
	Наличие помутнения	-	+	+	+	+	+
	рН	6,5	6,5	7,0	7,0	7,5	7,5

Как видно из данных, представленных в табл. 5, практически для всех типов микроорганизмов в процессе культивирования не наблюдалось образование хлопьевидного осадка, за исключением культур 7, G. Для них характерно появление хлопков вследствие продуцирования экзоферментов в последние 72–120 ч. Использование оливкового масла бактериями в качестве источника энергии и углерода подтверждалось переходом окраски из золотисто-желтой в розовую, за счет образования в результате деструкции жировых веществ, альдегидов и жирных кислот, что вело к понижению величины рН. Данная зависимость наблюдалась для культур I, 7, G через 72–96 ч культивирования. Изменение прозрачности бульона, в основном, через 48 ч у всех культур, кроме контрольного варианта, свидетельствовало об интенсивном росте и развитии микроорганизмов.

Таким образом, в результате проведения данной части дипломной работы были исследованы морфолого-физиологические и культуральные свойства микроорганизмов и определена их видовая принадлежность. Так культуры 3,7, I относятся к роду Listeria, F- к роду Brochotrix, I – к Bacillus.

3.2 Влияние условий культивирования на свойства ферментного препарат а, продуцируемого культурой рода Listeria

Целью второго этапа эксперимента являлось определение оптимального времени культивирования для получения ферментного препарата с заданными свойствами.

На основании первой серии эксперимента для дальнейшего исследования были выбраны три культуры рода Listeria типа 3, 7, I, а также среды, содержащие следующие виды СПАВ: Превоцелл W-OF-7, Wetter HAC, Гамма и De-sol-A. Для получения биомассы исследуемых культур микроорганизмов, активизированных в первой части, готовили бактериальные суспензии. Для этого каждую выросшую культуру не скошенном агаре переносили в колбы Эрленмейера на 250 см³, содержащие по 200 см³ жидкой синтетической среды, приготовленной в соответствии с п. 2.2.1. Культивирование проводили при (380,5)⁰С при переменном механическом воздействии, осуществляемом на «Shaker Type» с частотой колебания 250 об/мин, с амплитудой 6 по 2 часа в сутки.

Через каждые 24 часа культивирования снимали следующие характеристики: подсчет величины КОЕ (п. 2.2.2), определение рН (п. 2.2.13), кислотности, мутности (п. 2.2.7), а также концентрации анионактивных и неионогенных СПАВ согласно п. 2.2.12.1 и п. 2.2.12.2. Для определения концентрации белка по Ярош, липолитической и протеолитической активностей брали сырую поверхностную культуру, которую получали путем высаливания NH₄(SO₄)₂ из пробы с расходом 30% от объема, согласно п. 2.2.8. Затем отделяли фугат от осадка. Оставшуюся часть (50 мл) выпаривали в фарфоровой чашке и готовили пробу для качественного анализа вещества по ИК-спектрам поглощения в соответствии с п. 2.2.14. Осадок растворяли в 25 мл дистиллированной воды и проводили определение протеолитической, липолитической активностей и концентрации белка. Данные результатов исследования для культур рода Listeria sp 3 приведены в табл. 6, типа 7 – в табл. 7, типа I – в табл. 8.

Степень вовлечения в конструктивный и энергетический обмен оценивали по изменениям интенсивности по ИК-спектров и концентрации СПАВ.

Как видно из данных, представленных в табл. 6–8 и на рис. величина КОЕ (колонии образующие единицы) для сред с Превоцелл W-OF (культура рода Listeria sp 3, I), Wetter HAC (3,7, I) начинала увеличиваться с начала культивирования, достигая максимума к 48 ч. Так для среды, содержащей Превоцелл W-OF-7 и культуру Listeria sp 3 lg КОЕ=3,05 и увеличивается до lg КОЕ=4,60. Затем данная величина начинала уменьшаться до lg КОЕ=3,70. Вероятно это можно объяснить тем, что в начале культивирования (0 ч) наблюдалось увеличение числа клеток в результате возрастания частоты клеточного деления, что соответствовало лаг-фазе. Вторая логарифмическая фаза характеризуется постоянной продолжительностью существования возникающих друг за другом клеток. Затем наблюдался переход в стационарную фазу размножения (достижение максимума lg КОЕ). После наступала фаза отмирания, когда биомасса клеток уменьшается за счет автолитических процессов и лимитирования по субстрату для Превоцелл W-OF-7 (культура Listeria sp 3) до lg КОЕ=3,70. Увеличение величины КОЕ также подтверждается возрастанием мутности. Для Превоцелл W-OF-7 (культура типа 3) и Wetter HAC (культура типа 7) мутность повышается с 0,04 до 0,17 и с 0,035 до 0,22 соответственно. Lg КОЕ увеличивается до определенного момента, а затем уменьшается, а мутность постоянно возрастает. Это можно объяснить увеличением концентрации белка с 0 до 1,55 г./дм³ – для среды, содержащей Превоцелл W-OF-7 (культура типа 3) и с 0 до 1,05 г./дм³ – для cреды, содержащей Wetter HAC (культура типа 7).

Характеристики

Список файлов ВКР