107348 (684116)
Текст из файла
“Перфторан”: революционная комбинация
Андрей Артурович Недоспасов, д.х.н., Наталия Владимировна Беда, м.н.с., Институт молекулярной генетики РАН
“Нет ничего более практичного, чем хорошая теория” - фундаментальная наука неизбежно находит выход в практику. Увы, в родном отечестве эта аксиома все чаще оказывается теоремой, проблемой, а то и просто иллюзией. Быть может, фундаментальные исследования, описанные в этой работе, позволят восстановить статус-кво и минимизировать ущерб от возникшего дисбаланса.
Многие лекарственные препараты и методы лечения, открытые задолго до “эры NO”, в большей или меньшей степени влияют на метаболизм оксидов азота, но действие это часто остается незамеченным, а лечебные эффекты объясняются какими-то другими причинами. Яркий пример тому - клиническое применение искусственных кровезаменителей на основе перфторорганических соединений (ПФС), известных в России под названиями “Голубая кровь” и “Перфторан” [1-3].
Идея ПФС-кровезаменителей возникла в конце 60-х годов XX в. Поскольку жидкие ПФС прекрасно растворяют кислород, эмульсии из них могли бы выполнять газотранспортную функцию эритроцитов крови. Исследования активно велись в Японии, СССР и США. В 80-е годы, во время афганской войны, опытные партии советских препаратов спасли немало жизней раненым, обреченным на неминуемую смерть от потери крови. В настоящее время “Перфторан” допущен к клиническому применению и свободно продается в аптеках.
Со временем выяснилось, что применение “Перфторана”, в том числе в малых дозах, часто дает положительные эффекты, для которых связь с его газотранспортной функцией не просматривается. Одновременно обнаружили ряд побочных эффектов, также не находивших объяснения. Сегодня многие из них стали понятны благодаря представлениям о мицеллярном окислительном нитрозировании *. Этот термин, предложенный нами для введения радикала ·NO в гетерогенной среде, подразумевает, что в значительной степени реакции идут по радикальному механизму: молекула NO реагирует со свободным радикалом, образовавшимся из молекулы-мишени под действием ·NO2 - продукта окисления NO.
* Подробнее см.: Недоспасов А.А., Беда Н.В. Биогенные оксиды азота // Природа. 2005. №7. С.33-39.
Перфторуглеводороды (ПФУ) - экстремально гидрофобные вещества с большим коэффициентом распределения Q для кислорода и NO в смесях с водой. Кислород растворяется в них (в гидрофобной фазе эмульсии) гораздо лучше, чем в воде или плазме крови, из-за чего они и нашли применение в составе кровезаменителей. Благодаря мицеллярному катализу микрокапли эмульсии в крови действуют как губки для обоих газов, именно в них происходит теперь основная часть окисления NO.
В предыдущей статье мы рассматривали влияние гидрофобных фаз на процессы окисления NO (например, при образовании холестериновых бляшек на стенке кровеносного сосуда). При сравнении с эмульсией ПФС-кровезаменителей заметны три существенных отличия.
Во-первых, гораздо выше значения Q. Поскольку ускорение реакции окисления NO при введении оптимальных количеств гидрофобной фазы пропорционально QNO в присутствии “Перфторана” окисляется гораздо быстрее [4, 5]. При этом увеличиваются скорости нитрозирования и других процессов, зависимых от мицеллярного катализа, - все они протекают преимущественно в искусственной гидрофобной фазе или на границе раздела фаз. Концентрация NO в водной фазе первоначально падает, что приводит к активации ферментов NO-синтаз, поставляющих NO.
Во-вторых, капли эмульсии не смачивают стенки сосудов (перфторуглеводороды вообще ничего не смачивают из имеющихся в организме поверхностей раздела фаз). Более того, NO из холестериновых бляшек и других “обычных” гидрофобных фаз также частично переходит в капли эмульсии. Значит, повреждающее действие продуктов окисления NO на стенки сосудов уменьшается.
В-третьих, линейные размеры капель эмульсии в “Перфторане” менее 0.1 мкм (диаметр эритроцита ~20 мкм, а холестериновой бляшки много больше); соответственно, отношение поверхности к объему оптимально для протекания реакций нитрозирования на границе раздела. Если в окружающем пространстве присутствуют тиолы (RSH), капля эмульсии может действовать как миниатюрный реактор по производству тионитритов (RSNO). В норме в плазме крови довольно высокая концентрация восстановленного глутатиона (трипептида, содержащего остаток цистеина со свободной HS-группой), нитрозоформа которого - прекрасный донор NO.
Таким образом, аналогия капли перфторуглеводородной эмульсии с эритроцитом оказалась гораздо глубже, чем полагали сначала: оба переносят и кислород, и углекислый газ, и NO/RSNO. Понятно, что даже малые дозы кровезаменителей типа “Перфторана”, введенные в кровяное русло, обладают эффектом, характерным для нитроглицерина (основы динамита и одновременно популярного лекарства), т.е. вызывают релаксацию сосудов и восстанавливают кровообращение.
В первых опытах на крысах было наглядно продемонстрировано влияние эмульсий перфторуглеводородов на метаболизм NO: при введении “Перфторана” наблюдались предсказанные колебания концентраций нитрита и нитрата в плазме, изменения частоты сердечных сокращений, обычные при действии вазодилаторов типа нитроглицерина. Ингибирование NO-синтаз снимало эти эффекты [6]. Несколько лет спустя эту работу повторили в США [7].
Побочные эффекты применения кровезаменителей типа “Перфторан” во многих случаях проявлялись не сразу, а спустя значительное время после переливания крови. Поверхностно-активные вещества, используемые для стабилизации эмульсий при создании ПФУ-кровезаменителей, выводятся из организма гораздо быстрее, чем сами ПФУ (характерные времена - сутки и месяц соответственно). Если в первые часы после введения эмульсия становится основным местом окисления NO, то через сутки процессы перемещаются главным образом в естественные липидные фазы организма, в которых растворились ПФУ. Ясно, что в организме они (в виде отдельной фазы или растворенные в имеющихся гидрофобных фазах) будут влиять не только на параметры мицеллярного окисления NO из-за роста QO2 и, особенно, QNO, но и на все последующие процессы, включая нитрование и нитрозирование липидов, белков и нуклеиновых кислот. Таким образом, “отравления” под действием химически инертных перфторуглеводородов, в том числе газообразных, растворяющихся в липидах, можно объяснить потерей устойчивости системы регуляции метаболизма оксидов азота.
Рис.1. Схема биосинтеза NO и основные метаболические пути оксидов азота.
Ускорение окисления NO кислородом отражается на равновесии высших оксидов азота; при этом их стационарные концентрации меняются. Если электрофильное нитрозилирование (образование RSNO, рис.1) преимущественно протекает под действием NO+ (N2O3, N2O4), а радикальные реакции (включая нитрование и окисление белков и нуклеиновых кислот) - под действием ·NO2, то при использовании искусственных гидрофобных фаз в качестве кровезаменителей желательно сместить равновесие в сторону первых, во всяком случае не увеличивать стационарные концентрации NO2.
Концентрации высших оксидов азота при окислении NO чрезвычайно низки, и измерить их обычными методами не удается. Мы нашли простой и чувствительный способ, основанный на определении нитрата в продуктах окисления. Нитрат восстанавливается в нитрит соединениями ванадия, скорость этого процесса измеряют с помощью реакции Грисса (по образованию красителя). Если из образца удалить имевшийся первоначально (до восстановления нитрата) нитрит, весь образовавшийся краситель будет происходить из нитрата. Поскольку в результате гидролиза N2O3 получается только нитрит
N2O3 + H2O = 2HNO2, (1)
а при гидролизе N2O4 - эквимолярная смесь нитрита и нитрата
N2O4 + H2O = HNO2 + HNO3, (2)
доля нитрата в продуктах будет мерой стационарных концентраций обоих оксидов. В целом, в малополярных гидрофобных фазах стабилизация N2O3 при сольватации минимальна, распад на NO и NO2 усиливается, и доля NO2 должна расти:
NO2 + NO = N2O3. (3)
Анализ системы уравнений для стационарных концентраций оксидов азота показал, что возможно снижение [NO2]ст независимо от изменений [NO]ст и общего пула оксидов азота [8]. В частности, избирательно ускоряя нитрозилирование, мы снижаем не только [N2O3]ст, но и [NO2]ст, т.е. скорости всех радикальных реакций с его участием. В этой связи поиск катализаторов нитрозилирования/денитрозилирования становится важной задачей биохимии.
Рис.2. Гистограмма, отражающая вклад гетерогенности среды и катализаторов денитрозирования в баланс нитрит/нитрат при окислении NO. Слева: в гетерогенной среде скорость окисления NO выше, чем в гомогенной. Обычно система равновесий высших оксидов азота сдвигается в сторону NO2 и N2O4, и доля нитрата в продуктах возрастает. Triton X 100 - детергент (аналог мыла), использованный для получения липосом (по данным Liu et al., 1998). Справа: хотя в CF-эмульсиях скорость окисления NO возрастает сильнее, чем в обычных липидах, сольватация и скорости гидролиза высших оксидов азота изменены. В присутствии “Перфторана” доля нитрата в продуктах ниже, чем в гомогенном водном растворе (левая пара столбиков). Фосфат (PO4– 3 ), пиро- (P2O7–4 ) и триполифосфат (P3O10–5 ) ускоряют гидролиз N2O3 в нитрит. В результате стационарные концентрации NO2 и N2O4 уменьшаются и выход нитрата падает. Видно, что полифосфат гораздо активнее, чем фосфат. Hepes - компонент буферного раствора.
Сравним влияние гетерогенности среды и сольватации на нитрит-нитратный баланс в продуктах окисления NO в присутствии обычных липидов и в “Перфторане” (рис.2). Видно, что в первом случае при добавлении гидрофобной фазы доля нитрата (а значит, вызываемых ·NO2 радикальных реакций!) растет, во втором оказывается ниже, чем в гомогенном водном растворе [9]. Отчасти эффект связан с каталитическим действием полиэфирного стабилизатора эмульсии на реакцию нитрозирования. Его можно усилить с помощью других найденных нами катализаторов. На рис.2 в качестве иллюстрации показаны каталитические эффекты фосфата и триполифосфата. При увеличении скорости гидролиза N2O3 (фактически - нитрозилирования воды) уменьшаются стационарные концентрации как N2O3, так и NO2 из-за сдвига равновесия в реакции (3).
Впрочем, и здесь не обошлось без парадоксов и неожиданностей. Перфторуглеводороды и их гетероаналоги (вещества, содержащие помимо C и F другие атомы; например, перфтороктилбромид - ПФБ), близкие по растворяющей способности в отношении кислорода, считались одинаково инертными. Поэтому при создании кровезаменителей выбор конкретных соединений был случайным и определялся в значительной степени давлением пара и доступностью в чистом виде. (В промышленности ПФУ и их гетероаналоги получают для далеких от медицины целей, в частности для электротехники.) Так, основу “Перфторана” составляет смесь изомеров перфтордекалина и перфтор-(4-циклогексил,N-метил)пиперидина (рис.3). В Японии и США наиболее популярен перфтороктилбромид (C8F17Br, ПФБ; в кровезаменителях “Перфлюброн”, “Оксиджент” и др.).
Рис.3. Формулы перфторорганических соединений, используемых в производстве кровезаменителей.
Интересно, что сегодня перфтороктилбромид применяется при искусственной вентиляции легких. В легкие пациента (чаще в одно) вводят жидкий ПФБ (~1 л) и шланг с распылителем для подачи воздуха или кислорода. По завершении процедуры шланг удаляется, а ПФБ остается в легких и медленно (недели-месяцы) выводится с выдыхаемым воздухом, а часть его обнаруживается в крови.
Неоднократно отмечалось, что физиологические свойства и кровезаменителей на основе перфторуглеводородов, перфтороктилбромидов и чистых компонентов различны. Причины этого оставались непонятными. Действительно, если бы эффекты этих соединений сводились лишь к транспорту кислорода, они были бы одинаковы для всех ПФУ и ПФБ, поскольку значения коэффициента распределения NO для перфтороктилбромидов и не содержащих атома брома перфторсоединений, включая перфтордекалин (основной компонент “Перфторана”), также оказались близкими. Таким образом, объяснить различные физиологические эффекты только разной сольватацией NO не удалось. В этой связи мы поставили под сомнение постулат об инертности перфтороктилбромидов in vivo и начали искать природные супернуклеофилы, способные реагировать с ним при температуре тела [10].
Для перфторалкилгалогенидов были известны реакции перфторалкилирования при катализе низковалентными комплексами никеля и кобальта. Наиболее известная форма существования кобальта in vivo - кобаламин (витамин В12), который в восстановленной форме служит кофактором ряда ферментов (рис.4). Мы показали, что кобаламин активирует ПФБ, видимо, с образованием перфтороктильного радикала и Co(II), который может снова восстанавливаться до Co(I). Значит, витамин В12 в присутствии восстановителей играет роль катализатора перфторалкилирования под действием ПФБ. Реакцию удалось “визуализировать” с использованием флюоресцирующих мишеней. В тех же условиях связь C-F оказалась устойчивой: мы не обнаружили перфторалкилирования под действием перфтордекалина. Судьба гидрофобных перфторалкильных радикалов in vivo остается неизвестной. Вероятно, они способны эффективно реагировать с NO (природным инактиватором свободных радикалов), образуя новые токсичные продукты.
Рис.4. Схема катализа кобаламином (витамином В12) реакций перфторалкилирования под действием перфторалкилгалогенидов. In vivo кобаламин восстанавливается до Со+1. Этот супернуклеофил способен “вырвать” атом брома из молекулы перфторалкилбромида (показана как CFBr). Образующийся перфторалкильный радикал CF· вступает в реакции с активированными двойными связями (показан замещенный акриламид, Х - флюоресцирующая группа), ароматическими соединениями и др. Вновь образовавшиеся радикалы (2) стабилизируются различными путями, приводя к стабильным CF-содержащим продуктам (3, 4).
Принципиальное отличие ПФУ и ПФБ в отношении к супернуклеофилам типа восстановленных форм кобаламина позволяет объяснить различие свойств кровезаменителей на их основе: ПФБ в физиологических условиях нельзя считать химически инертным. Аналогичные объяснения применимы и к многочисленным отравлениям другими перфторалкилгалогенидами (ПФГ): помимо механизмов, связанных с NO-катастрофами, они могут участвовать в реакциях перфторалкилирования обычных метаболитов. Ясно, что низкие концентрации кобаламина в тканях делают их малозаметными, но не менее неприятными, особенно при больших “периодах полувыведения” (мера времени жизни в организме) высших гомологов. Не исключено, что в качестве восстановителей ПФГ, помимо B12, могут выступать и другие метаболиты. Поскольку современный уровень знаний не позволяет оценить отдаленные последствия и степень риска, эксперименты с использованием перфторалкилгалогенидов на людях следовало бы предельно ограничить.
Характеристики
Тип файла документ
Документы такого типа открываются такими программами, как Microsoft Office Word на компьютерах Windows, Apple Pages на компьютерах Mac, Open Office - бесплатная альтернатива на различных платформах, в том числе Linux. Наиболее простым и современным решением будут Google документы, так как открываются онлайн без скачивания прямо в браузере на любой платформе. Существуют российские качественные аналоги, например от Яндекса.
Будьте внимательны на мобильных устройствах, так как там используются упрощённый функционал даже в официальном приложении от Microsoft, поэтому для просмотра скачивайте PDF-версию. А если нужно редактировать файл, то используйте оригинальный файл.
Файлы такого типа обычно разбиты на страницы, а текст может быть форматированным (жирный, курсив, выбор шрифта, таблицы и т.п.), а также в него можно добавлять изображения. Формат идеально подходит для рефератов, докладов и РПЗ курсовых проектов, которые необходимо распечатать. Кстати перед печатью также сохраняйте файл в PDF, так как принтер может начудить со шрифтами.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
