94623 (682188), страница 4

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 4)

Вміст ІА у фракціях, одержаних після поетапного розподілу методом афінної хроматографії сироваток крові хворих на ЦД-1 на сорбентах інсулін-сефароза та білок G-сефароза

Примітка: Iнс. – інсулін, + – позитивний зразок; – сумнівний зразок; - – негативний зразок за вмістом ІА, визначених даними методами.

Отримані дані можна проаналізувати таким чином. Якщо у разі визначення ІА та ІАА в сироватках крові людей методами РІА та ІФА результати визначення вмісту цих антитіл збігаються (сироватки від хворих П-ко, Гр-й, Б-в, С-н), то після розподілу сироваток крові на зазначених сорбентах та визначенні в них ІА та ІАА цей висновок залишається незмінним. В іншому ж випадку, коли нефракціоновані сироватки, за даними РІА, вважались позитивними (сироватки Т-ч, М-я), а за методом ІФА – негативними, то визначення вмісту ІА та ІАА в окремих фракціях, елюйованих з обох типів сорбентів, дало змогу впевненіше стверджувати про відсутність їх в таких сироватках крові. Так, у фракціях сироваток крові хворих Т-ч та М-я навіть при досить значному вмісті білка, ІА не були виявлені (для порівняння див. дані хроматографії сироватки хворого П-ко).

Заслуговують на увагу також результати хроматографічного розподілу білків сироватки крові хворого С-н. При дослідженні такої нефракціонованої сироватки методом РІА зв’язування її білків з ¹²⁵І-інсуліном було незначне (8,4-16,1 %), а при дослідженні методом ІФА вона вважалась позитивною. Останнє підтвердилось результатами поетапної хроматографії цієї сироватки крові: при незначній кількості білка в елюаті з інсулін-агарози (ОГ при = 280 нм становила 0,085) у зразку чітко визначались ІА. Ці результати ще раз підтвердили, що при використанні методу РІА, враховуючи його особливості, існує ймовірність осадити разом з антитілами всі БЗІ, для виділення та дослідження яких слід застосувати спеціальні методичні підходи.

Таким чином, в результаті проведеної роботи з’ясовано, що використовуючи метод поетапної афінної хроматографії на сорбентах з інсуліном і білками А або G з сироваток крові донорів і хворих на ЦД можна виділити і дослідити низку білків, які мають властивість зв’язуватись з інсуліном. Запропонований спосіб може бути використаний для визначення співвідношень білків, що зв’язують інсулін у крові хворих на ЦД; та разом з визначенням ІА та ІАА опрацьованим імуноферментним методом це сприятиме глибшому розумінню можливої природи різних ускладнень, що виникають у хворих на ЦД в процесі лікування препаратами інсуліну.

Висновки

1. Вперше застосовано метод поетапної афінної хроматографії на сорбентах з інсуліном та білком А (або G) і продемонстровано його придатність для відокремлення антитіл до інсуліну від інших білків, що зв’язують інсулін в сироватках крові хворих на ЦД та здорових людей. Показано, що вміст білкових чинників, причетних до зв’язування інсуліну, в сироватках хворих на ЦД в 2,5 – 3 рази вищий, ніж у здорових людей.

2. Вперше в Україні розроблено метод гетерогенного твердофазного імуноферментного аналізу для визначення вмісту антитіл до ендогенного та екзогенного інсулінів у крові людей. Доведено його ефективність для виявлення ІА та ІАА, як в цільній сироватці крові людей, так і у складі білкових фракцій, виділених методом поетапної афінної хроматографії з цих сироваток.

3. Встановлено, що специфічність розробленого імуноферментного методу становить 90,9 %, а чутливість – 82,4 %; внутрішньосерійний коефіцієнт варіації складає 9,09 % для негативних зразків і 3,53 % для позитивних, а міжсерійний – 4,34 % для негативних зразків і 5,5 % для позитивних.

4. На основі розробленого методу створено вітчизняну імуноферментну тест-систему “ІФА-АТ-інс” та показано її придатність для виявлення ІА та ІАА при обстеженні здорових людей та хворих на ЦД.

5. За допомогою розробленої тест-системи проведено визначення антитіл до ендогенного та екзогенного інсулінів в сироватках крові здорових людей, та хворих на ЦД-1 і ЦД-2, які приймали таблетовані цукрознижуючі препарати, ін’єкції інсуліну або його аналогів. Відсоток осіб, у крові яких виявлено ІА або ІАА, у групі хворих на ЦД-1 дорівнював 10,96; у хворих на ЦД-2, лікованих інсуліном – 4,26; хворих на ЦД-2, які не отримували інсулін – 1,92. Серед донорів ІАА виявлено у однієї особи (0,52 % від загальної кількості обстежених).

6. Проведене порівняльне дослідження тест-системи “ІФА-АТ-інс” з імуноферментною комерційною системою “Anti-insulin ORG-520” виробництва фірми “ORGentech” (Німеччина), засвідчило її ефективність при визначенні антитіл до екзогенного (або ендогенного) інсуліну.

Список опублікованих праць за темою дисертації

Статті в наукових спеціалізованих виданнях

1. В.В. Корпачев, С.В. Мельниченко, Р.Г. Лукашова, Н.В. Іванська, Г.Є. Раєвська. Опрацювання методу імунофентного аналізу для визначення антитіл до інсуліну у сироватці крові здорових людей та хворих на цукровий діабет // Ендокринологія, 2003, Т. 8, №1, С.24-30 (Автором самостійно здійснювався аналіз літератури, підбір хворих, експериментальні дослідження (підбір оптимальних умов проведення імуноферментного аналізу), статистична обробка та узагальнення матеріалів, написання статті).

2. В.В. Корпачев, С.В. Мельниченко, П.М. Карабун, Р.Г. Лукашова, Н.В. Іванська. Порівняння розробленої імуноферментної тест-системи (“ІФА-АТ-інс”) з комерційними наборами для виявлення антиінсулінових антитіл у сироватках крові людей // Ендокринологія, 2003, Т. 8, №2, С.158-168 (Автор самостійно здійснювала аналіз літератури, проводила порівняльні дослідження розробленої імуноферментної тест-системи „ІФА-АТ-інс” з комерційними наборами: імуноферментною тест-системою “Anti-insulin ORG-520” та радіоімунною – “Cis biointernational”).

3. В.В. Корпачев, Н.М. Гуріна, С.В. Мельниченко, Р.Г. Лукашова, А.А. Шупрович. Білки, що зв’язують інсулін, та контррецепторні білки сироватки крові хворих на цукровий діабет і здорових людей // Ендокринологія. - 2004.-Т.9.-№2.-С.221-235 (Автором здійснювалось написання фрагменту статті на підставі власних експериментальних досліджень сироваткових чинників, що блокують дію інсуліну (афінна хроматографія, електрофорез в поліакриламідному гелі).

4. В.В. Корпачев, С.В. Мельниченко, Р.Г. Лукашова, П.М. Карабун, Н.В. Іванська. Антигенність інсуліну та методи визначення антитіл до нього в сироватках крові здорових людей та хворих на цукровий діабет // Ендокринологія. - 2005.-Т.10.-№2.-С.206-223 (Автором самостійно здійснювався пошук літератури за темою, експериментальні дослідження (імуноферментне визначення вмісту антитіл), статистична обробка та узагальнення матеріалів, написання статті. ).

Статті в наукових виданнях

1. Р.Г. Лукашова, С.В. Мельниченко. Методы определения антител к инсулину. // В кн. В.В Корпачева: Инсулин и инсулинотерапия.- Киев, РИА «Триумф», 2001.- С.309-322 (Пошук літератури та її аналіз, оформлення).

2. В.В. Корпачев, С.В. Мельниченко, Р.Г. Лукашова, П.М. Карабун, Н.В. Іванська. Дослідження цукрознижувальної та антигенної властивостей Новорапіду – аналога людського інсуліну ультракороткої дії // Клінічна ендокринологія та ендокринна хірургія, 2004, №3 (8), С.46-52 (Автором здійснювались: аналіз літератури, експериментальні дослідження (визначення вмісту антитіл до інсуліну), участь у написанні статті).

3. С.В. Мельниченко, Н.В. Іванська, В.В. Корпачев. Патогенетичне значення антитіл до ендогенного та екзогенного інсулінів // Сімейна медицина. – 2005.- №3.- С.45-47 (Аналіз літератури, написання статті).

Тези доповідей на наукових конференціях і з’їздах

1. С.В. Мельниченко, В.В. Корпачев, Р.Г. Лукашова, О.А. Шевчук, Н.В. Іванська. Розробка методу визначення антитіл до інсуліну в сироватці крові людей на основі твердофазного імуноферментного аналізу // Ендокринологія, 2001, Т.6 (додаток), С. 194.

2. В.В. Корпачев, С.В. Мельниченко, Н.В. Иванская, Г.А. Раевская, Р.Г. Лукашова. Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления антител к инсулину в сыворотках крови людей // Материалы I съезда аллергологов Украины, 2002, С. 79.

3. В.В. Корпачев, Н.В. Иванская, С.В. Мельниченко, Р.Г. Лукашова, Г.Е. Раевская. Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления антител к инсулину // Укр. біохім. ж., 2002, 74, 4а (додаток 1), С.101-102.

4. С.В. Мельниченко. Розробка тест-системи для визначення антитіл до інсуліну в сироватці крові людей на основі твердофазного імуноферментного аналізу // Ендокринологія, 2002, Т. 7, №1, С.142.

5. В.В. Корпачев, Н.М. Гурина, С.В. Мельниченко. Нарушение толерантности к глюкозе у крыс после введения инсулинсвязывающих белков из сыворотки крови интактных животных // Укр. біохім. журнал.- 2002.- Т.74, №4а (додаток 1).- С.147.

6. С.В. Мельниченко. Выделение и анализ инсулинсвязывающих белков сывороток крови больных сахарным диабетом // Укр. биохим. журнал.- 2006.- Т.2, (спец.выпуск).- С.88.

7. В.В. Корпачев, Н.В. Іванська, Р.Г. Лукашова, С.В. Мельниченко. Розробка та апробація імуноферментної тест-системи для виявлення антитіл до інсуліну // Вісник Вінницького держ. Мед. університету.- 2003.- №1-2.- с.57.

8. В.В. Корпачев, Р.Г. Лукашова, С.В. Мельниченко, П.М. Карабун. Визначення вмісту антитіл до інсуліну та дослідження інших інсулінзв’язуючих білків в сироватці крові хворих на цукровий діабет // Ендокринологія. - 2007.-Т.12 (додаток).-С.122.

Патент

1. В.В. Корпачев, Р.Г. Лукашова, С.В. Мельниченко, О.А. Шевчук, Н.В. Іванська, Г.Є. Раєвська, В.Г.Пилипенко. “Тест-система для виявлення аутоантитіл до ендогенного або антитіл до екзогенного інсулінів в сироватках та плазмі крові людей (ІФА-АТ-інс)” // Деклараційний патент на винахід 57640 А “Тест-система для виявлення аутоантитіл до ендогенного або антитіл до екзогенного інсулінів в сироватках та плазмі крові людей (ІФА-АТ-інс)” 16.06.2003.- бюл. №6.

Анотація

Мельниченко С.В. Виділення та характеристика білкових чинників, що зв’язують інсулін в крові людей, хворих на цукровий діабет. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 14. 01. 14 – ендокринологія. – Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України, Київ, 2007 р.

Дисертаційну роботу присвячено дослідженню білкових чинників (БЗІ), які здатні зв’язувати інсулін в крові людей, хворих на цукровий діабет, і визначенню антитіл до ендогенного (ІА) або екзогенного (ІАА) інсулінів у складі цих білків.

Білки, що зв’язують інсулін в сироватках крові людей, виділяли методом афінної хроматографії на сорбенті інсулін-сефароза 4В. Отриманий матеріал в подальшому фракціонували на сорбенті білок G-сефароза 4В, відокремлюючи при цьому ІА та ІАА від інших білків, що блокують дію інсуліну. Всі отримані білкові фракції досліджували методом електрофорезу в поліакриламідному гелі. Вміст ІА та ІАА, як в нативних сироватках, так і в отриманих фракціях, визначали розробленим гетерогенним твердофазним імуноферментним методом. В результаті проведення поетапної афінної хроматографії сироваток крові хворих на ЦД та донорів показано, що кількість білкових фракцій в елюатах (як від донорських сироваток, так і від хворих на ЦД) коливається від 8 до 10. Співвідношення білків в окремих зразках різні, але кількість фракцій не залежить від того, з яких сироваток – від здорових людей чи від хворих на ЦД – виділено ці білки.

На основі опрацьованого гетерогенного твердофазного імуноферментного методу визначення ІА та ІАА створено тест-систему “ІФА-АТ-інс”. Проведено порівняльне дослідження тест-системи “ІФА-АТ-інс” з імуноферментною комерційною системою “Anti-insulin ORG-520” виробництва фірми “ORGentech” (Німеччина) засвідчило її ефективність при виявленні антитіл до екзогенного (або ендогенного) інсуліну як у нативних сироватках, так і в складі білкових фракцій, виділених методом поетапної афінної хроматографії з сироваток крові людей. Використання методу поетапної афінної хроматографії і дослідження вмісту ІА та ІАА в отриманих елюатах дозволило пояснити розбіжності в результатах визначення цих антитіл методами імуноферментного та радіоімунного (РІА) аналізів. Причиною такого явища може бути те, що в РІА, для вилучення комплексів ¹²⁵І-інсуліну з ІА або ІАА використовують поліетиленгліколь. Останній, крім антитіл до інсуліну, здатен осаджувати також й інші БЗІ і тим самим, призводити до завищення результатів визначення ІА та ІАА.

Ключові слова: цукровий діабет, інсулін, антитіла до інсуліну; білки, що зв’язують інсулін, імуноферментний аналіз.

Характеристики

Список файлов реферата