94623 (682188), страница 3

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 3)

У процесі роботи ми випробували не тільки МКА до ІgG людини, мічені пероксидазою хрону, але й поліклональні антитіла (ПКА) до всіх класів імуноглобулінів, одержані шляхом імунізації кіз (Всеросійський інститут сільськогосподарських технологій, Москва). Розведення кон’югату з МКА становило 1: 100 000, з ПКА – 1:10 000 (табл. 3).

Таблиця 3

Вміст ІА та ІАА в сироватках крові хворих на цукровий діабет

з використанням різних кон’югатів

Примітки:

1. Тло – проба без внесення сироватки.

2. МКА-Пх – моноклональні антитіла до імуноглобулінів людини класу G, мічені пероксидазою хрону.

3. ПКА-Пх – поліклональні антитіла до імуноглобулінів людини класу G, мічені пероксидазою хрону.

Як видно з представлених даних, реакція деяких сироваток (34, 42, 6, 10, 423) в ІФА була інтенсивніша з МКА, ніж з ПКА; з іншими сироватками (38, 99, 482) отримано протилежні результати. Пояснення цьому може полягати як в гетерогенності ІА та ІАА в цих зразках щодо їхньої спорідненості, так і в належності їх до різних підкласів IgG. ПКА, навіть проти однієї – єдиної антигенної детермінанти, гетерогенні як за структурою активного центра, так і за фізико-хімічними властивостями. У тому випадку, коли антиген полівалентний, як наприклад інсулін, в сироватці крові утворюються антитіла, які направлені проти кожної окремої детермінанти (епітопа); це призводить до ще більшого урізноманітнення антитіл. Усі ці фактори впливають на гетерогенність антитіл та обумовлюють певні труднощі при дослідженні їх структури та визначенні вмісту в крові [А.М. Егоров, 1991].

На початкових етапах розробки імуноферментного методу як хромоген використовували ОФД, який потребує дотримання особливих умов безпеки, пов’язаних з канцерогенними властивостями цієї речовини. Хоча ОФД і досі включають у деякі комерційні імуноферментні набори, та все ж останнім часом більш безпечним хромогеном вважають ТМБ, оскільки він сам та його метаболіти не проявляють мутагенної та канцерогенної дії [Н.В. Іванська, 2003]. З даних порівняльного аналізу хромогенів ОФД та ТМБ випливає, що при використанні обох хромогенів різниці в отриманих результатах практично немає, тому в подальшому застосовували ТМБ.

Розроблений імуноферментний метод використано для обстеження дорослих хворих на ЦД та донорів (табл. 4). Отримані результати значною мірою збігаються з даними, які наводяться в літературних джерелах [Ueno H. et al., 1994; Schloot N.C. et al., 1997; Zigler A.G. et al., 1999;].

Таблиця 4

Результати виявлення антитіл до інсуліну в сироватках крові дорослих людей опрацьованим імуноферментним методом

Примітки: 1) +Iнс. – хворі на ЦД-2, які отримували препарати інсуліну; 2) -Iнс. – хворі на ЦД-2, які не отримували препарати інсуліну; * – достовірно стосовно групи донорів (за критерієм ч ²).

Опрацьований метод використали також для визначення вмісту ІА та ІАА в сироватках крові різних груп дітей. У жодної здорової дитини не було виявлено ІАА, в той час як у групі ризику захворювання на ЦД-1 ІАА були наявні в 5,71 % дітей. Серед дітей, хворих на ЦД-1, ІА та ІАА знайдено в 16,67 % осіб. Таким чином, показано, що розроблений імуноферментний метод придатний для визначення ІА та ІАА в сироватках крові дорослих і дітей.

Основні діагностичні характеристики будь-якого методу, які свідчать про його надійність – це чутливість, специфічність та відтворюваність отримуваних результатів.

Встановлено, що специфічність розробленого імуноферментного методу становить 90,9 %, а чутливість – 82,4 %; внутрішньосерійний коефіцієнт варіації складає 9,09 % для негативних зразків і 3,53 % для позитивних, а міжсерійний – 4,34 % для негативних зразків і 5,5 % для позитивних.

На основі розробленого твердофазного імуноферментного методу для визначення вмісту антитіл до ендогенного або екзогенного інсулінів у співавторстві з працівниками НВК “Діапроф-Мед” було створено тест-систему, яку назвали “ІФА-АТ-інс”.

Розроблену систему “ІФА-АТ-інс” порівнювали з комерційною імуноферментною тест-системою “ORG-520” (“ORGentech”, Німеччина). Деяка різниця в результатах визначення ІА обома методами може бути зумовлена різними способами оцінки граничної зони та особливостями застосованих кон’югатів.

Підсумовуючи отримані результати, можна зробити висновок, що тест-система “ІФА-АТ-інс” подібна до імуноферментної комерційної “Anti-insulin ORG-520”, відповідає вимогам, поставленим до тест-систем на основі ІФА для визначення ІА та ІАА і може бути використана для виявлення їх у сироватках крові людей.

Тест-систему “ІФА-АТ-інс” порівнювали також з комерційним радіоімунним набором “IA-AIA CIS biointernational” (Франція). При цьому проведено дві серії досліджень. Для першої серії експериментів відібрали сироватки крові 10 донорів та 79 хворих на ЦД, серед яких 48 хворих на ЦД-1 і 31 – на ЦД-2. Для другої серії відібрали сироватки від 92 хворих на ЦД-1 та ЦД-2.

У першій серії експериментів при дослідженні 48 сироваток крові від хворих на ЦД-1 методом ІФА зафіксовано 14 позитивних сироваток, 32 негативні і два сумнівних зразки. Аналіз тих же сироваток методом РІА виявив 11 позитивних та 20 негативних зразків, у 15 сироватках зв’язування міченого інсуліну з ІА становило або було менше за 20 %, тобто ІА містились в низьких титрах. З 31 сироватки крові від хворих на ЦД-2 методом ІФА визначено 2 позитивних і 29 негативних зразків, а методом РІА – 2 і 27 сироваток, відповідно. Останнім методом виявлено також 2 сироватки з низькими титрами ІА. При дослідженні донорських сироваток розбіжностей між отриманими результатами не виявлено.

Постановка другої серії експериментів принципово не відрізнялась від першої. Після визначення ІА у сироватках крові хворих на ЦД невідповідні результати отримано в 5 зразках.

Таким чином, після дослідження сироваток крові хворих на ЦД тест-системою “ІФА-АТ-інс” та “IA-AIA CIS biointernational” виявилось, що у деяких випадках отримані результати не співпадають. Подібні розбіжності спостерігали й інші дослідники [L.Nell et al., 1989; K.F. Federlin, 1993; D. Devendra et al., 2003, 2004]. Пояснення цього може полягати в тому, що визначення антитіл проведено методами, які суттєво відрізняються один від одного. При застосуванні РІА, в якому використовують поліетиленгліколь, крім ІА та ІАА можуть осаджуватись й інші БЗІ, і тим самим призводити до завищення вмісту визначених ІА та ІАА. Цим можна пояснити і значну кількість сироваток з невеликим (7-20) відсотком зв’язування з ¹²⁵І-інсуліном, які, згідно з інструкцією, слід відносити до позитивних.

Існують певні труднощі в інтерпретації результатів визначення ІА та ІАА у людей з ЦД. Вони полягають у тому, що в цієї категорії хворих, в залежності від віку, тривалості інсулінотерапії, типу ЦД, а також особливостей імунного статусу організму, утворюються ПКА з високою або низькою афінністю проти різних епітопів інсуліну. Слід також брати до уваги, що ендогенний або екзогенний інсулін, який міститься в сироватці хворих, здатен зв’язуватись з ІА та ІАА, утворюючи комплекси інсулін-антитіло, і тим самим змінювати кількість ІА або ІАА при визначені різними методами.

Оскільки при порівнянні тест-системи “ІФА-АТ-інс” з комерційною радіоімунною “Cis biointernational” результати визначення ІА та ІАА у частині зразків крові хворих на ЦД не співпадали, то для з’ясування можливих причин розбіжності та для більш детального дослідження БЗІ застосовували поетапну афінну хроматографію таких сироваток на сорбентах з інсуліном та білком G.

Методом поетапної афінної хроматографії з сироваток крові різних хворих на ЦД і здорових людей було виділено білкові фракції, що мають властивість зв’язуватись з інсуліном. Для цього були проаналізовані зразки сироваток крові хворих на ЦД, де кількість ІА та ІАА, визначених методами ІФА та РІА, суттєво відрізнялась (табл. 5).

Таблиця 5

Кількість білка, виділеного методом поетапної афінної хроматографії

з 1 мл сироватки крові хворих на ЦД та донорів

Примітка: Н/д – не досліджувалось

Загальна особливість перших трьох таких сироваток (Ф-в, Т-ч, М-я) така, що при дослідженні вмісту ІА та ІАА методом ІФА вони визначені як негативні, а при використанні РІА – як позитивні. З певною пересторогою можна вважати за контрольні дві інші сироватки хворих на ЦД-1 (Б-в, Т-в), в яких не знайшли ІА та ІАА обома застосованими методами.

З одержаних даних витікає, що в досліджених зразках крові міститься різна кількість БЗІ, проте не всі вони належать до білків імуноглобулінової природи.

Однак ці результати свідчили тільки про різницю в кількості білків, виділених на обох типах сорбентів з сироваток крові хворих на ЦД та донорів; фракції, вимиті з названих сорбентів, не були досліджені на вміст ІА. Ми вважали за доцільне провести аналогічні дослідження окремих сироваток, в яких при проведенні РІА і ІФА була розбіжність щодо вмісту ІА. Використання поетапної афінної хроматографії для таких зразків з подальшим аналізом отриманих фракцій методом ІФА дало можливість обґрунтованіше стверджувати про наявність або відсутність ІА та ІАА у нативних сироватках. Результати проведених досліджень наведено в табл. 6.

Таблиця 6

Характеристики

Список файлов реферата