Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 2)

На рис. 1 подано типову картину електрофоретичного розподілу білків, що зв’язують інсулін в сироватці крові хворих на ЦД та донорів.

Аналіз електрофореграм дає змогу зробити висновок, що інсулін-сефарозний сорбент вилучає з сироваток крові значну кількість білків, що мають різну молекулярну масу. В результаті проведення поетапної афінної хроматографії сироваток крові хворих на ЦД та донорів показано, що кількість білкових фракцій в елюатах (як від донорських сироваток, так і від хворих на ЦД) коливається від 8 до 10. Проте, слід зазначити, що електрофоретична рухливість окремих білкових фракцій, отриманих з сироваток крові людей, хворих на ЦД, дещо відрізняється від рухомості аналогічних фракцій, виділених з сироваток крові донорів.

Для детальнішого дослідження БЗІ в сироватках крові здорових людей і хворих на ЦД застосовували поетапну афінну хроматографію таких сироваток на сорбентах з інсуліном та білком А (виділяють з Staphylococcus aureus) або білком G (отримують з Streptococcus sp.). Білки А та G мають властивість зв’язуватись з Fc-фрагментом IgG людини, тому використання останніх сорбентів спрямовано на відокремлення білків імуноглобулінової природи від інших БЗІ.

Хроматографічне фракціонування сироваток крові на афінних сорбентах з інсуліном і білком А (або G), показало, що в однакових об’ємах сироваток крові хворих на ЦД і донорів міститься не тільки різна кількість БЗІ, але й різна кількість білків імуноглобулінової природи.

Так, в одному з експериментів з 5 мл сироватки крові від 10 хворих на ЦД-1 на колонці з інсуліном (h = 3 см, d = 1 см) виділено 5,87 мг білків, що зв’язують інсулін, а при розподілі їх на сорбенті з білком А (h = 1,5 см, d = 1 см) – 1,036 мг білків імуноглобулінової природи. У другому досліді, за таких же умов, отримано 5,384 і 0,753 мг білка, відповідно. При дослідженні у такий же спосіб 5 мл сироваток крові від 10 донорів одержали 1,83 мг БЗІ, з яких на частку антиінсулінових IgG припадало лише 0,182 мг, тобто майже в 5 разів менше, ніж при виділенні обох типів досліджуваних білків з сироваток крові хворих на ЦД-1.

Цими дослідами показано, що вміст білка в окремих фракціях БЗІ, за умов однотипної постановки хроматографічних та електрофоретичних досліджень, різний, в залежності від того, одержали їх з сироваток крові здорових людей, чи з сироваток хворих на ЦД.

Подальша робота з розподілу білків сироватки крові від 65 донорів (V=100 мл) та 27 хворих на ЦД-1 (V=25 мл) зазначеним вище методом поетапної хроматографії проводилась з використанням рідинного хроматографа “BioRad”. На рис. 2 представлено профілі елюції білків, що зв’язуються з інсулін-сефарозою (пік 2 на обох графіках), та рехроматографія їх на сорбенті з білок G-сефарозою (піки 3, 4 на графіках А і В).

При хроматографічному розподілі БЗІ на сорбенті з білок G-сефарозою вдалося відокремити білки, які за молекулярною масою можуть бути окремими ланцюгами IgG (пік 4), від інших БЗІ (пік 3). Після порівняння обох графіків дійшли висновку, що розподіл білків сироваток крові здорових людей і хворих на ЦД-1 на цих сорбентах дуже схожий і відрізняється тільки кількісним вмістом білка в кожній фракції; такий результат може бути обумовлений особливостями вихідного матеріалу.

Примітки:

1. Білки, які не зв’язалися з інсуліновим сорбентом ;

2. Білки, які зв’язалися з інсуліновим сорбентом (елюати з інсулінового сорбенту);

3. Елюати з інсулінового сорбенту, які не зв’язались з білком G;

4. Білки, елюйовані з сорбенту білок G-сефароза 4В (антитіла до інсуліну).

З даних електрофореграм видно, що застосування білок G-сефарози дає змогу розподілити БЗІ, отримані з інсулінового сорбенту, на дві фракції. Одна з них, за всіма ознаками, належить до білків імуноглобулінової природи – важких і легких ланцюгів IgG, з молекулярною масою близько 60 та 30 kДa. До складу другої фракції входять інші БЗІ. Електрофореграми білків, здатних зв’язуватись з інсуліном, але не реагувати з білком G (який має властивість з’єднуватись з Fc-фрагментом IgG), налічує значну кількість смуг, найвиразніша з яких розташована в зоні білків з молекулярною масою, притаманною альбумінам (66 kДa). Ще одна смуга, розташована над альбуміновою зоною, відповідає зоні трансферину (78 kДa). З даних літератури відомо, що у хворих на ЦД саме ці білки зазнають змін у кількісному відношенні [T. Sundsten et al., 2005]. Можна також припустити, що окрему групу БЗІ складають фрагменти -субодиниць інсулінового рецептора з молекулярною масою біля 70 кДа. Що стосується інших БЗІ, які не сорбуються на білок G-сефарозі, то їх ідентифікація потребує подальших досліджень, оскільки для висновку щодо належності окремих смуг у всіх представлених електрофореграмах до певного типу білків необхідні додаткові дослідження їх і перш за все – імуноблотинг з використанням, наприклад МКА до альбуміну, трансферину, окремих фрагментів імуноглобулінів (Fc, Fab) та до інших білків.

Враховуючи те, що значна частина виділених БЗІ за всіма ознаками належить до імуноглобулінів, які відіграють суттєву роль при різноманітних патофізіологічних станах, ми вважали за доцільне дослідити їх детальніше. Це спонукало нас до опрацювання власного методу ІФА для визначення ІА та ІАА в сироватках крові людей. У подальшому цей метод планувалось використати для визначення їх вмісту в усіх білкових фракціях, виділених методом поетапної афінної хроматографії з сироваток крові здорових людей та хворих на ЦД.

При відпрацюванні початкового етапу – зв’язування антигену з твердою фазою, були апробовані планшети типів “PoliSorp”, “MediSorp” та “MaxiSorp” виробництва фірм “Dynatech” і “Nunc”. Ми дійшли висновку, що для нашої мети найбільш придатні планшети типу “MediSorp” і всю подальшу роботу проводили з використанням саме цих носіїв.

Для розведення сироваток та блокування неспецифічного зв’язування сироваткових білків із вільними від інсуліну місцями на планшеті використовували розчин знежиреного молока в 0,1 М фосфатно-сольовому буферному розчині з додаванням твіну 20.

При визначенні оптимальної концентрації інсуліну, необхідної для сорбції на твердій фазі, використовували кристалічний напівсинтетичний інсулін людини виробництва фірми “Hoechst”. Показано, що застосування розчину інсуліну з концентрацією 25 мкг / мл є найбільш вдалим, оскільки в цьому випадку співвідношення ОГ всіх позитивних за вмістом ІА сироваток (0,423) до ОГ всіх негативних (0,051) – найкраще (табл. 1). Збільшення концентрації інсуліну в розчинах для сорбції (50 мкг / мл) не призводило до суттєвого поліпшення результатів. Проте, використання інсуліну в високих концентраціях може призвести до нашарування молекул гормону, які під час відмивання зсуваються й частково видаляються разом із промивним розчином (0,1 М фосфатно-сольовий буферний розчин з 0,05 % тритоном Х-100).

Незважаючи на те, що при використанні розчинів з меншим вмістом інсуліну реєструються вищі значення ОГ, існує можливість отримати хибно-позитивні результати за рахунок сорбції ІgG сироватки крові з “вільними” місцями в лунках планшетів (див. результати визначення вмісту ІА в сироватках № 482 і № 468).

Таблиця 1

Результати визначення антиінсулінових антитіл у сироватках крові здорових людей та хворих на цукровий діабет при використанні різних концентрацій напівсинтетичного інсуліну людини (“Hoechst”) у розчині для сенсибілізації планшетів “Dynatech”

Примітки: тло – проба без сироватки; жирним шрифтом позначено ОГ, що перевищує граничне значення; курсивом позначено ОГ, що знаходиться в межах граничних значень; результати представлено в одиниця ОГ.

При опрацюванні методу проводились експерименти, мета яких полягала у з’ясуванні можливості використання інсулінів різного походження та виробництва різних фірм для сенсибілізації твердої фази. Це мало суто практичний інтерес, бо дає змогу, у разі потреби, замінити інсулін людини фірми “Hoechst”, на інший – з таким же ефектом. Для цього відібрали кристалічні інсуліни людини та свині, лікарські форми інсулінів, а для порівняння – А21-монодезамідоінсулін (табл. 2).

Як видно з табл. 2, при визначенні вмісту ІА в одних і тих самих сироватках, отримано подібні результати (ОГ/ГЗ негативних зразків від 0,021 до 0,028; ОГ/ГЗ позитивних зразків від 2,61 до 3,61) при використанні всіх інсулінів, крім А21-монодезамідоінсуліну (ОГ/ГЗ негативних зразків 0,013, а позитивних – 0,99), що можна пояснити наявністю в нього специфічних антигенних детермінант.

Таблиця 2

Вміст антитіл до інсуліну у відібраних позитивних та негативних сироватках крові людей за умов сенсибілізації планшетів різними інсулінами

Примітки:

1. Результати представлені як співвідношення ОГ/ГЗ, де ОГ – оптична густина проби, ГЗ – граничне значення в системі.

2. Жирним шрифтом виділено значення, які перевищують граничні.

3. Сироватки: В-к, М-ко, 46 – здорових людей; 449, 470, 79 – хворих на ЦД (негативні за вмістом антитіл до інсуліну); 102, 151, 171, 423, 506, 554 – хворих на ЦД (позитивні за вмістом антитіл до інсуліну).

4. Використані інсуліни: біосинтетичний кристалічний інсулін людини: 1 – “Lilly” (США), 2 –“Novo Nordisk” (Данія); напівсинтетичний кристалічний інсулін людини “Hoechst” (Німеччина) – 3; біосинтетичний інсулін людини “Актрапід НМ” (“Novo Nordisk”) – 4; напівсинтетичний інсулін людини “Інсуман Рапід” (“Індар”, Україна); інсулін свині кристалічний (“Hoechst”) – 6; інсулін свині “Актрапід МС” (“Novo Nordisk”) – 7, “Моноінсулін МК” (“Індар”) – 8; аналог інсуліну людини “NovoRapid” (“Novo Nordisk”) – 9; кристалічний A21-монодезамідоінсулін людини (“Novo Nordisk”) – 10.

Важлива умова успішного проведення ІФА – підбір кон’югату вторинних антитіл до Іg людини з ферментом та його концентрації, оскільки при високій концентрації кон’югату спостерігається надлишкове неспецифічне зв’язування його з носієм, а при низьких концентраціях – чутливість аналізу може знижуватись в результаті уповільненого перетворення субстрату на продукт ферментативної реакції. До такого ж висновку дійшли й інші дослідники [А.В. Масяго, 2002; Н.В. Іванська, 2003].

Характеристики

Список файлов реферата