93927 (681722), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Замена "грязных" стандартов. Очень часто не понимают значения и причин замены одного стандарта на другой, более высокой степени чистоты. Если меняется международный стандарт, то последствия непонимания причин такой замены могут проникнуть в национальное законодательство, промышленность и клиническую практику. Поэтому очень важно ясно представлять себе, почему заменен данный стандарт и что в этом случае следует делать.
~ Рассмотрим первый стандарт, в данном количестве которого (массе, содержимом ампулы) содержится х молекул вещества А и некоторое количество молекул, сходных по ряду свойств (например, иммунореактивности) с веществом А. Этот стандарт заменяют на другой, содержащий удвоенное количество 2х (на мг или на ампулу) чистого вещества А. Когда второй стандарт анализируют с помощью метода, специфичного к А (т.е. когда определяется только А), то результаты анализа должны Показать удвоенное содержание А во втором стандарте по отношению к первому стандарту. Если же второй стандарт анализируют с помощью метода, в котором взаимодействуют и примеси, подобные А, и находящиеся в первом стандарте, то количество вещества А во втором стандарте по данным этого анализа будет меньше Ъс. Степень занижения результатов зависит от специфичности данного анализа. Эта проблема описана в работе [3] и проиллюстрирована на рис. 2.1. Как отмечал профессор Финяи, важна не столько математика биологической стандартизации, сколько понимание лежащих в ее основе принципов.
Последствия внедрения международного стандартного препарата (МСП) для определения хорионического гона-дотропина человека. Ярким примером того, какие недоразумения могут возникнуть при замене "грязного" международного стандарта на другой, содержащий более чистый материал, является ситуация, возникшая в ходе внедрения второго международного стандарта (МО хорионического гонадотропина человека (hCG) для калибровки международного стандартного препарата (МСП), предназначенного для иммуноанализа hCG. Определение hCG в сыворотке крови или в моче используют для диагностики ранних стадий беременности. Естественно, чем более чувствителен тест, тем ранее он даст положительный сигнал. При перекалибровке различных продажных наборов по новому МСП в тех наборах, в которых происходило неспецифическое взаимодействие с многочисленными примесями, содержащимися во 2-м МС (а- и /5- субъединицы, денатурированные формы hCG), пришлось менять градуировку стандартов, входящих в-наборы. В результате такой замены ухудшилась истинная чувствительность определения почти всех наборов. Последствия оказались весьма неприятными, поскольку пришлось давать объяснения медикам и потребителям наборов. Такие объяснения были опубликованы [4, 5]. Корректность нового МСП была подтверждена с помощью специфических моноклональных антител [6]. Этот пример не является единственным. Подобная ситуация может возникнуть сейчас после введения в 1986 г. нового международного стандарта для FSH; перекалибровка соответствующих иммуноаналитических наборов (в некоторых случаях в 5 раз), по-видимому, встретится с теми же трудностями, что и в случае hCG.
Первый международный стандарт для гипофизар-ного FSH. Ввиду важности определения гипофизарного и сывороточного FSH первый международный стандарт и второй МСП были введены именно для этих гормонов (МСП также для LH). Эти МСП были приготовлены профессором Рейчертом в лаборатории профессора Вильгельми путем экстракции гипофизов, хранившихся в ацетоне. Оригинальный исходный материал известен в Америке под шифром LER 907. Часть этого материала была лиофилизо-вана в ампулах (код 69/104) в Отделе биологических стандартов NIMR и в дальнейшем была использована в качестве научно-исследовательского стандарта. Полученный препарат был принят ВОЗ в 1.973 г. в качестве МСП для биоанализа гипофизарных FSH и LH [7 ]. Когда первая серия ампул (около 3500 штук) была израсходована, в качестве второго МСП для биоанализа FSH и LH стали использовать новую серию (код 78/549), также полученную из LER 907. Хотя различные аликвоты одного и того же материала были обработаны аналогичным образом [8], нельзя утверждать, что по составу LER 907, 69/104 и 78/549 идентичны, поскольку неизвестно, какие молекулярные изменения произошли в образцах в процессе хранения и лиофилизации.
Начиная с 1973 г. были проведены многочисленные исследования по изучению свойств гипофизарного FSH и введению чистого стандарта. Эта работа была проделана профессором Е.Дизфалу-си, Д.Робертсоном и А.Завди в Каролинском институте в Стокгольме и профессором П.Сторрингом в Отделе эндокринологии Национального института биологических стандартов и контроля (National Institute for Biological Standards and Control, NIBSC) в Лондоне. С помощью элегантных и детальных экспериментов были обнаружены изогормоны, сильно различающиеся по своей биологической активности [9, 10]. Несмотря на гетерогенность гормона, было принято решение в качестве нового стандарта использовать смесь этих гликопротеидов. В соответствии с правилами Экспертного комитета ВОЗ по биологической стандартизации в качестве стандарта был выбран экстракт, обладающий самой высокой фол-ликулостимулирующей активностью in vivo. Соответствующий тест основан на определении увеличения массы яичников в группе неполовозрелых крыс, получавших определенные дозы FSH и избыток LH в течение 4-5 дней.
Был выбран и лиофилизован в ампулах лучший образец. После предварительной проверки новый стандарт был калиброван против МСП для биоанализа гипофизарных FSH и LH 27 группами ученых в 13 странах. Эксперименты включали также использование ряда других калиброванных материалов, в том числе и соответствующих сывороток.
2.3.7. Введение единицы международного стандарта FSH. Эксперименты по стандартизации нового препарата гипофизарного FSH были спланированы и выполнены д-ром Сторрингом и д-ром Дас. Полученные результаты, которые позднее будут опубликованы полностью, можно отнести к одной из трех групп: 1) около 80 м.ед. FSH на ампулу при биоанализе in vivo; 2) около 30 м.ед. FSH на ампулу при биоанализе in vitro и в рецепторном тесте; 3) около 16 м.ед. FSH на ампулу по данным различных видов им-муноанализа.
Какой же тип анализа должен быть взят за основу для введения нового стандарта? Согласно рекомендациям ВОЗ, это должен быть биоанализ in vivo, поскольку это единственная известная система, в которой сиалилированные и гликозилированные изогормоны FSH, а также их метаболиты оцениваются по физиологическому эффекту на интактные клетки in situ. С другой стороны, можно утверждать, что биоанализ in vitro и рецепторный тест позволяют определить количество активного гормона точнее, однако полученные результаты сильно зависят от качества изолированных тканей, клеток и рецепторов, которые в процессе обработки могут модифицироваться, например, ферментами. Кроме того, данные методы не отражают естественные межклеточные взаимодействия и слишком непродолжительны по времени, чтобы зафиксировать другие медленнр проявляющиеся эффекты активности FSH. Более низкие результаты иммуноанализа можно объяснить перекрестными реакциями антител с другими гликопротеинами и примесями, содержащимися в МСП гипофизарных FSH и LH.
Следует помнить, что биоанализ гормонов in vivo широко используется и хорошо описан в научной литературе и руководствах по фармакологии. Одни и те же линии крыс и мышей имеются во многих лабораториях мира, поэтому наблюда£й<г*,реакция связана только с биологической активностью гормона. В случае же иммуноанализа используемые реагенты сильно различаются по составу. и имеют ограниченное время жизни. Характеристики каждой системы анализа редко бывают детально документированы, и наблюдаемые колебания результатов' (например, доля связанной метки), как правило, не связаны с биологической активностью гормона.
Поскольку новый стандарт должен представлять активный FSH, то величина 80 м.ед. на ампулу кажется наиболее обоснованной. Большинство участников международных испытаний согласились с этим выводом, и позднее Экспертный комитет ВОЗ по биологическим стандартам утвердил материал с кодом 83/575 в качестве третьего международного стандарта FSH с содержанием 80 м.ед. на ампулу.
2.3.8. Последствия введения нового МС. Решение принять величину 80 м.ед. FSH на ампулу в качестве третьего междуна-/ родного стандарта имеет далеко идущие последствия как для фирм, выпускающих соответствующие наборы, так и для клиницистов. Первым придется перекалибровать их собственные стандарты и наборы, а также переоценить специфичность анализа. В клинической химии необходимо провести большую учебную и разъяснительную работу. Например, величина отношения LH/FSH, часто использующаяся при диагнозе поликистоза яичника, после введения нового стандарта изменится. Ясно, что введение нового МС потребует много времени. В переходный период было предложено использовать оба стандарта, однако производителям и потребителям наборов и редакторам периодических научных журналов рекомендовалось указывать, какой стандарт в каждом случае использовали при определении FSrf. Такой подход был принят после введения очищенного МСП для hCG, и можно надеяться, что он сгладит неудобства переходного периода как для поставщиков, так и для клиницистов.
После принятия более чистого стандарта для FSH должны быть введены и стандарты для субъединиц или подобных FSH веществ, если будет доказано, что их определение представляет практический интерес. При необходимости будут введены международные стандарты и для изолированных а- и /3-субъединиц FSH.
В этой работе процедуре замены международных стандартов было уделено много внимания, поскольку, по мнению автора, очень часто замена стандартов вызывает недоразумения только потому, что не поняты важность и сущность этого процесса.
ТЕХНОЛОГИЯ РЕХОМБИНАНТНЫХ ДНК
В последние годы для крупномасштабного получения труднодоступных пептидов все более широкое распространение получают методы генной инженерии (технологии рекомбинантных ДНК). Некоторые из белков (инсулин, гормон роста), полученных этим методом, абсолютно идентичны природным белкам человека. Другие вещества, например гликопротеин эритропоэтин, идентичны нативным веществам по структуре полипептидной цепи, но немного отличаются от них по строению боковых углеводных цепей в зависимости от продуцирующей линии животных клеток. Получение белков и некоторых гликопротеинов в качестве стандартов генно-инженерным путем наиболее удобно в случае труднодоступных объектов (интерлейкины la и /?, ренин, интерфероны человека). Проблемы контроля производства и детального исследования свойств рекомбинантных продуктов рассмотрены в работах [П, 12].
ПРИМЕНЕНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ
Применение моноклональных антител для йммуноанализа пептидов требует большой осторожности, поскольку высокоспецифичные моноклональные антитела могут взаимодействовать, например, только с одним из изогормонов. По этим же причинам нельзя использовать "слишком" специфичные моноклональные антитела и для аффинной очистки пептидов. Кроме того, существует опасность разрушения образца при его элюировании с аффинной колонки под действием рН и ионной силы раствора. И наконец, следовые количества антител могут загрязнять очищенный продукт и влиять на результаты анализа.
ПРИГОТОВЛЕНИЕ СТАНДАРТНЫХ ПРЕПАРАТОВ ГАПТЕНОВ
Высокоочищенные стандартные препараты гаптенов можно получить от производящих их фирм и из некоторых некоммерческих источников, например из коллекции стандартов стероидов Медицинского научно-исследовательского центра. Многие гаптены (например, определенные гормоны и лекарства) довольно плохо и с различной аффинностью связываются с белками крови, поэтому частично (обычно < 5%) они находятся в свободном виде. Ранее иммуноанализу многих гаптенов предшествовало их выделение экстракцией. В последнее время интенсивно разрабатываются методы определения суммарного количества определенного гаптена в сыворотке или плазме без его выделения. Кроме того; разработан прямой разделительный метод для определения не связанного С белками свободного гаптена (например, свободного Т4) в сыворотке. Эти Разработки включают создание и калибровку соответствующих матриксов, состав которых является коммерческим секретом. По-видимому, получение идеального матрикса, пригодного для решения любой физиологической или патологической задачи, является недостижимой целью.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
