Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ІМ. О.В. ПАЛЛАДІНА НАН УКРАЇНИ

ШИМАНСЬКИЙ ІГОР ОЛЕКСАНДРОВИЧ

УДК 612.82+577.164.15+616-03

МОЛЕКУЛЯРНІ МЕХАНІЗМИ

РЕАЛІЗАЦІЇ НЕЙРОТРОПНОЇ ДІЇ ВІТАМІНУ РР

ТА ЙОГО БІОЛОГІЧНО АКТИВНИХ ПОХІДНИХ

03.00.04 – Біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор, член-кор. НАН України Донченко Георгій Вікторович, завідувач відділу біохімії коферментів Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Цудзевич Борис Олександрович, старший науковий співробітник лабораторії фізико-хімічної біології Київського національного університету імені Тараса Шевченка;

доктор медичних наук, професор Мхітарян Лаура Сократівна, керівник відділу біохімії ННЦ “Інститут кардіології ім. М.Д. Стражеска” АМН України.

Захист відбудеться “ 17 ” березня 2008 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 при Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України за адресою: 01601, м. Київ, вул. Леонтовича, 9.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України за адресою: м. Київ, вул. Леонтовича, 9.

Автореферат розісланий “ 15 ” лютого 2008 р.

Учений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук О.В. Кірсенко

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Новий інтерес до вітаміну РР, пов’язаний з можливістю його ефективного застосування у неврологічній практиці [Stevens M.J. et al, 2007], обумовлює доцільність подальшого з’ясування конкретних механізмів біологічної дії вітаміну за різних функціональних станів нервової системи. Нині цілком очевидно, що більшість функцій вітаміну РР реалізується у клітинах через його нуклеотидні похідні, зокрема NAD⁺ та NADP⁺ [Maiese K., Chong Z., 2003]. Хоча NAD⁺ упродовж багатьох десятиліть і був відомий лише як основний акцептор гідрид-іонів у метаболічних реакціях оксидоредукції [Magni G. et al, 1999], останнім часом все більшу увагу привертає його регуляторна роль. Так показано, що NAD⁺ є субстратом у таких важливих клітинних регуляторних процесах, як ковалентна модифікація білкових молекул (моно та полі-ADP-рибозилювання) [Ame J.C. et al, 2004], реакції деацетилювання гістонів за участю Sir2, нещодавно відкритого класу ферментів, які беруть участь у регуляції “генного сайленсингу” [Yu S.W. et al, 2002]. Поряд з цим, NAD⁺ та NADP⁺ необхідні для синтезу відповідно циклічної ADP-рибози та NAADP⁺ – важливих медіаторів кальцієвих сигнальних шляхів [Guse A.H., 2005]. Порушення у будь-якому з цих процесів потенційно може спричинювати дисфункції клітин, призводячи до підвищення ризику розвитку нейродегенеративних захворювань.

Нейротропні ефекти вітаміну РР за нормальних фізіологічних умов та за розвитку деяких патологічних станів нервової системи можуть здійснюватись, принаймні частково, на рівні регуляції процесів синаптичної передачі, опосередкованих NAD⁺. У синаптичних мембранах головного мозку щурів виявлено існування NAD-модуляторної системи, фізіологічне значення якої полягає у спряженні специфічного зв’язування NAD⁺ синаптичними мембранами з процесом їхньої деполяризації, що індукує вивільненням нейромедіаторів із нервових закінчень [Халмурадов А.Г. и др., 1983]. Молекулярний механізм такого спряження не виключає можливості залучення мембранних систем транспортування катіонів та деяких компонентів основних шляхів клітинної сигналізації. З огляду на це, актуальною є оцінка можливості функціональної взаємодії NAD-модуляторної системи з системами транспортування катіонів та сигнальної трансдукції. Дослідження молекулярних механізмів некоферментної дії NAD⁺ на синаптичні закінчення, що реалізуються через специфічну рецепцію нуклеотиду NAD-зв’язувальним білком синаптичних мембран, дозволить розширити уявлення щодо механізмів нейротропної дії вітаміну РР.

У контексті з’ясування молекулярних механізмів, які лежать в основі некоферментної функції вітаміну РР, велике значення має вивчення NAD-модуляторної системи синаптичних закінчень за різних функціональних станів нервової системи. Відомо, що дефіцит вітаміну РР та піридинових нуклеотидів або порушення у їх обміні можуть викликати селективну нейродегенерацію внаслідок патогенетичних змін окисно-відновних процесів та регуляторних функцій в нервових клітинах насамперед тих, що залучені до контролювання синаптичної активності. Раніше показано, що NAD-зв’язувальний білок бере участь у реалізації нейротропної дії вітаміну РР за експериментальних РР-гіповітамінозу, епілепсії та хвороби Паркінсона [Фоменко А.И. и др., 1997; Кучмеровська Т.М., 1998]. Не достатньо з’ясованими, однак, залишаються питання, наскільки у патогенезі різних захворювань нервової системи зміни в ключових NAD⁺-залежних регуляторних процесах, зокрема моно та полі-ADP-рибозилюванні білків, впливають на NAD-рецепцію та процеси нейротрансмісії та якою мірою вітамін РР може залучатись до регуляції зазначених процесів.

Для більш глибокого розкриття конкретних біохімічних механізмів, відповідальних за нейротропну дію вітаміну РР та його похідних у функціонуванні збудливих клітин, нами проведено дослідження на експериментальній моделі цукрового діабету 1 типу (ЦД1). Оцінка характеру порушень NAD-модуляторної системи у взаємозв’язку з рівнем нікотинамідних динуклеотидів головного мозку, деякими NAD-утилізуючими та NAD-генеруючими процесами, а також функціональним станом серотонінергічної системи є актуальною та сприятиме як з’ясуванню патогенетичного значення змін NAD-модуляторної системи за діабетичної невропатії, так і, в цілому, кращому розумінню її біологічної ролі у функціонуванні синаптичних закінчень та у механізмі нейротропної дії вітаміну РР.

Мета та завдання роботи. Метою роботи було дослідження молекулярних механізмів участі NAD⁺ у функціонуванні NAD-модуляторної системи головного мозку щурів та механізмів нейротропної дії вітаміну РР і його біоактивних похідних за експериментального цукрового діабету 1 типу. Відповідно до поставленої мети в роботі вирішувались наступні завдання:

1. Дослідити молекулярні механізми нейромодуляторної дії NAD⁺ на синаптосомальній моделі:

- З’ясувати роль іонних каналів при NAD-індукованій деполяризації синаптичних мембран головного мозку щурів;

- Вивчити вплив NAD⁺ на активність Na⁺,К⁺-АТPази синаптосом та синаптичних мембран головного мозку;

- Оцінити можливість існування функціонального взаємозв’язку NAD-модуляторної системи з компонентами ключових систем внутрішньоклітинної сигналізації у нервових закінченнях;

- У порівняльному аспекті дослідити концентраційнозалежні ефекти нікотинаміду (NAm) та NAD⁺ на трансмембранний цитоплазматичний потенціал нервових закінчень та вивільнення серотоніну синаптосомами головного мозку.

2. Вивчити функціональний стан NAD-модуляторної системи за експериментального ЦД1 та за умов введення нікотинаміду.

3. Дослідити роль сигнального шляху G_s-білок/cAMP/PKA пресинаптичних закінчень у модуляції синаптичної активності за цукрового діабету та у механізмі нейротропної дії вітаміну РР та його похідних.

Об’єкт дослідження: процеси модуляції синаптичної активності за різних функціональних станів нервової системи та у механізмі реалізації нейротропної дії вітаміну РР і його похідних.

Предмет дослідження – поглинання та вивільнення нейромедіаторів ізольованими синаптичними закінченнями, генерування мембранного потенціалу, стан системи антиоксидантного захисту та пероксидне окислення ліпідів, підтримання структурно-функціональної цілісності геному у нервовій системі нормальних і діабетичних щурів та за введення сполук з РР-вітамінною активністю.

Методи дослідження: виходячи з основних задач дослідження, проведено експериментальне моделювання цукрового діабету 1 типу та інтенсифікації біосинтезу NAD⁺ в організмі, використано біохімічні (методи ензимології, препаративної біохімії, біокінетики), біофізичні методи, методи радіорецепторного аналізу та статистично-математичні.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дана дисертаційна робота є частиною фундаментальних досліджень відділу біохімії коферментів Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України за темами “Дослідження механізмів реалізації біологічної дії вітамінів, коферментів та їх специфічних білків-акцепторів в регуляції метаболізму спеціалізованих клітин” (1997-2001); “Вивчення механізмів функціональної взаємодії вітамінів А, С, Д, РР, В₁ та Q в організмі тварин в нормі та за умов деяких патологій” (2002-2006); “Дослідження молекулярних механізмів реалізації біологічної ролі вітамінів, коферментів та їхніх білків-акцепторів у забезпеченні функціонування та життєздатності клітин за норми та за умов деяких патологій” (2007-2011).

Наукова новизна одержаних результатів. Результати досліджень, проведених на моделі синаптосом, поглиблюють розуміння конкретних молекулярних механізмів секретогенної дії NAD⁺. Вперше встановлено, що деполяризація синаптичних мембран та стимулювальний вплив динуклеотиду на процес вивільнення серотоніну синаптосомами головного мозку опосередковуються активацією сигнальних шляхів протеїнкінази С та/або А і реалізуються через інгібування активності Na⁺,K⁺-АТPази за неконкурентним механізмом та активацію потенціалкерованих натрієвих каналів. Показано, що нейротропна дія нікотинаміду на рівні синаптичних закінчень у концентраціях, наближених до фізіологічних, найімовірніше здійснюється не прямо, а опосередковано через NAD⁺.

Отримані дані розкривають конкретні патогенетичні механізми розвитку діабетичної невропатії та свідчать про важливу роль порушень NAD-модуляторної системи в розвитку дисфункцій головного мозку за ЦД1. Вперше показано, що зростання специфічного зв’язування NAD⁺ синаптичними мембранами за цукрового діабету корелює з підвищенням як спонтанного, так і індукованого деполяризуючими агентами вивільнення серотоніну синаптосомами головного мозку, але спостерігається зниження вивільнення медіатору у відповідь на дію екзогенного NAD⁺. При цьому виявлено, що не існує прямої залежності між рівнем NAD⁺ у головному мозку та його зв’язуванням синаптичними мембранами.

Результати проведених досліджень свідчать про опосередкований полі-АDP-рибозополімеразою (Parp) механізм порушення біодоступності NAD⁺ при розвитку дисфункцій головного мозку за ЦД1. Зокрема, вперше продемонстровано можливий зв’язок між зростанням активності цього NAD-залежного ферменту у клітинних ядрах та зниженням вмісту динуклеотиду у головному мозку діабетичних щурів, що пов’язано з репарацією розривів ДНК в умовах виявленої інтенсифікації за діабету пероксидокислювальних та вільнорадикальних процесів. Вперше встановлено, що посилення моно-ADP-рибозилювання G_s-білків та активація сигнального шляху cAMP/протеїнкіназа A, принаймні частково, може бути ендогенним сигналом, який сприяє підвищенню вивільнення нейромедіаторів за цукрового діабету.

Механізм позитивної нейротропної дії за діабету нікотинаміду та нікотиноїл-ГАМК, введених у терапевтичних дозах, включає нормалізуючий ефект цих сполук на рівень NAD⁺ і специфічне зв’язування динуклеотиду синаптичними мембранами головного мозку, що корелює з нормалізацією процесів зворотного поглинання та вивільнення серотоніну ізольованими синаптичними закінченнями. Здатність вітаміну РР і його похідного ефективно коригувати NAD-опосередковані мембранні процеси за експериментальної діабетичної невропатії, принаймні частково, є результатом антиоксидантної дії цих сполук та інгібування процесів моно- і полі-АDP-рибозилювання білків.

Практичне значення одержаних результатів. Позитивна нейротропна дія вітаміну РР та його похідних, яка на рівні контролю синаптичної активності реалізуються опосередковано через NAD-зв’язувальний білок синаптичних мембран, обумовлює можливість та доцільність їх застосування з метою нормалізації специфічних нейрохімічних процесів у синаптичних закінченнях та забезпечення ефективної нейропередачі за діабетичної невропатії. Крім цього, продемонстровано можливість успішного використання нікотинаміду та нікотиноїл-ГАМК у фармакологічних дозах як інгібіторів загального ADP-рибозилювання та сполук з антисорбітоловими та антиоксидантними властивостями у лікуванні даного захворювання. Результати проведених досліджень також підтверджують, що порушення процесів рецепції NAD⁺ синаптичними мембранами та його нейромодуляторної дії можуть бути спільним проявом розвитку різних захворювань центральної нервової системи.

В цілому, проведені дослідження розширюють уявлення щодо механізмів біологічної дії вітаміну РР та нікотиноїл-ГАМК у головному мозку та складають теоретичне підґрунтя для подальшого вивчення досліджуваних сполук та інших біоактивних похідних на їх основі як препаратів, що використовуються з метою цілеспрямованої фармакологічної корекції порушень функціонування ЦНС за діабетичної невропатії та інших патологій нервової системи.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто підібрано та критично проаналізовано великий обсяг сучасної вітчизняної та зарубіжної літератури за темою запланованого наукового дослідження. Дисертантом розроблено конкретні схеми вирішення поставлених завдань, інтерпретовано отримані результати, підготовлено до друку публікації. Експериментальна частина роботи виконана особисто здобувачем. Аналіз та обговорення результатів досліджень проведено спільно з науковим керівником – зав. відділу біохімії коферментів Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, член-кор. НАН України, д.б.н., проф. Донченко Г.В. та пров. науков. співр. відділу біохімії коферментів Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна, д.б.н. Кучмеровською Т.М.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були представлені на VI з’їзді ендокринологів України (2001, Київ); VI міжнародній конференції “Биоантиоксидант” (2002, Москва); VIII Українському біохімічному з’їзді (2002, Чернівці); Установчому з’їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, 2004); V Парнасівській конференції (2005, Київ); міжнародній конференції “Рецепция и внутриклеточная сигнализация” (2005, Пущино, Росія); II Європейському Конгресі з фармакології (1999, Угорщина); V Всесвітньому Конгресі IBRO з нейронаук (1999, Єрусалим, Ізраїль); IX, XI, XII Конгресах “NEURODIAB Diabetic Neuropathy” Європейської Асоціації з Вивчення Діабету, EASD (1999, Маастріхт, Нідерланди; 2001, Абердін, Шотландія; 2002, Балатонфюред, Угорщина;); III об’єднаному З’їзді DFSG (група з вивчення діабетичної стопи) та NEURODIAB (2004, Регенсбург, Німеччина); 35, 36, 37, 38, 40, 41, 42, 43-му Щорічних Конгресах Європейської Асоціації з Вивчення Діабету (1999, Брюссель, Бельгія; 2000, Єрусалим, Ізраїль; 2001, Глазго, Великобританія; 2002, Будапешт, Угорщина; 2004, Мюнхен, Німеччина; 2005, Афіни, Греція; 2006, Копенгаген-Мальмо, Данія-Швеція; 2007, Амстердам, Нідерланди); 19-му Всесвітньому Діабетичному Конгресі (2006, Кейптаун, Південна Африка).

Характеристики

Тип файла документ

Документы такого типа открываются такими программами, как Microsoft Office Word на компьютерах Windows, Apple Pages на компьютерах Mac, Open Office - бесплатная альтернатива на различных платформах, в том числе Linux. Наиболее простым и современным решением будут Google документы, так как открываются онлайн без скачивания прямо в браузере на любой платформе. Существуют российские качественные аналоги, например от Яндекса.

Будьте внимательны на мобильных устройствах, так как там используются упрощённый функционал даже в официальном приложении от Microsoft, поэтому для просмотра скачивайте PDF-версию. А если нужно редактировать файл, то используйте оригинальный файл.

Файлы такого типа обычно разбиты на страницы, а текст может быть форматированным (жирный, курсив, выбор шрифта, таблицы и т.п.), а также в него можно добавлять изображения. Формат идеально подходит для рефератов, докладов и РПЗ курсовых проектов, которые необходимо распечатать. Кстати перед печатью также сохраняйте файл в PDF, так как принтер может начудить со шрифтами.

Список файлов реферата