92260 (680539), страница 3

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 3)

Рис. 6. Зв’язування [U-¹⁴C]NAD⁺ синаптичними мембранами головного мозку щурів: 1 – контроль; 2 – діабет; 3 – діабет + NAm (20 мг/кг); 4 - діабет + NAm (200 мг/кг); 5 - діабет + N-ГАМК (200 мг/кг)

Деполяризація синаптосом KCl (25 мМ) або 4-амінопіридином (4-AP, 0,1 мМ) індукувала вдвічі більш істотне, на додаток до базального, вивільнення серотоніну за діабету у порівнянні з контролем (рис. 7б). При цьому вивільнений серотонін в обох випадках, імовірно, походить з одного і того ж везикульованого пулу медіатору. Підвищена відповідь синаптосом на дію деполяризаторів за цукрового діабету узгоджується з можливістю посилення за патології ендогенного фосфорилювання певних ефекторних білків апарату екзоцитозу (Shoji-Kasai Y. et al, 2002). Як введення NAm, так і N-ГАМК призводило до часткової нормалізації процесів зворотного поглинання та вивільнення серотоніну синаптосомами головного мозку, але при цьому дія NAm була більш вираженою.

Рис. 7. Вивільнення [2-¹⁴C]серотоніну синаптосомами головного мозку (а) за дії екзогенного NAD⁺ (1 мкМ); (б) 4-амінопіридину та KCl: 1 – відповідний контроль; 2 – 4-АР (0,1 мМ); 3 – KCl (15 мМ), M m, n = 10-12

Доказом того, що індуковані цукровим діабетом порушення у функціонуванні центральних нейромедіаторних систем можуть включати зміни у нейромодуляторних процесах за участю NAD⁺ є те, що екзогенно доданий до суспензії навантажених [2-¹⁴С]серотоніном синаптосом головного мозку діабетичних щурів NAD⁺ (1 мкМ) виявився не здатним у порівнянні з контролем істотно стимулювати вивільнення медіатору (рис. 7а). Отже, загальні зміни вмісту NAD⁺ у клітинах мозку та порушення процесу його специфічного зв’язування за діабету, напевно, негативно позначаються на ефективності механізму функціонального спряження рецепторної та/або трансдукуючої/ефекторної ланки у клітинному сигналингу NAD⁺. Відновлення зв’язування супроводжувалось нормалізацією відповіді синаптосом на нейромодуляторну дію екзогенного NAD⁺ у групі тих діабетичних тварин, які отримували нікотинамід у дозі 200 мг/кг маси тіла.

4. Роль сигнального шляху G_s-білок/cAMP/протеїнкіназа А та процесів моно-ADP-рибозилювання синаптосомальних білків у вивільненні серотоніну за ЦД1 та при введенні вітаміну РР. Передача сигнальної інформації через NAD-зв’язувальний білок та нейрохімічні ефекти вітаміну РР і його біологічно активних похідних за умов ЦД1 можуть здійснюватись на рівні процесів, які пов’язані зі складною регуляцією синаптичної функції із залученням різних типів посттрансляційної модифікації функціонально важливих білкових молекул. Нами встановлено можливу патогенетичну роль активації сигнального шляху cAMP/протеїнкіназа А та PKA-залежного фосфорилювання у порушенні вивільнення серотоніну за цукрового діабету, так як H89, специфічний інгібітор PKA, знижує in vitro вивільнення [2-¹⁴С]серотоніну синаптосомами головного мозку діабетичних щурів (рис. 8).

Рис. 8. Спонтанне вивільнення серотоніну синаптосомами головного мозку щурів за умов інгібування сАМР-залежної протеїнкінази in vitro: 1 – контрольні щури; 2 – діабетичні щури; 3 – діабетичні щури, яким вводили нікотинамід (М ± m, n = 4-6)

Дія інгібітору РКА за двохтижневого введення NAm у дозі 200 мг/кг маси тіла нагадує його ефекти у недіабатичному контролі, що вказує на гальмування ендогенного фосфорилювання білків у механізмі нормалізації вивільнення серотоніну при введенні досліджуваної сполуки за ЦД1. У контексті вивільнення нейромедіаторів у літературі найдетальніше описано значення модифікації синаптичних білків саме шляхом фосфорилювання. Останнім часом з’являється дедалі більше даних стосовно його зв’язку з ендогенним моно-ADP-рибозилюванням білків, яке, імовірно, відіграє подібну роль [Ying W., 2006; Tsuyama S. et al, 1999]. Тому досліджували можливі зміни моно-ADP-рибозилювання неядерних білків у взаємозв’язку з дисфункціями мозку, асоційованими з діабетом. Отримані нами результати свідчать, що рівень конститутивного моно-ADP-рибозилювання синаптосомальних білків за діабету вищий на 34 % у порівнянні з контролем (рис. 9).

Рис. 9. Базальне та індуковане холерним токсином (СТХ) моно-ADP-рибозилювання білків синаптичних закінчень in vitro: 1 – контрольні щури; 2 – контрольні щури + СТХ; 3 – діабетичні щури; 4 – діабетичні щури + CTX; 5 – діабетичні щури, яким вводили NAm; 6 – діабетичні щури, яким вводили NAm + СТХ (М ± m, n = 6)

Після преінкубації з міченим NAD⁺ оцінювали індуковане холерним токсином специфічне моно-ADP-рибозилювання стимуляторної -субодиниці G-білків, позитивно спряжених з аденілатциклазою. Незважаючи на виявлену більш високу ефективність холерного токсину на вивільнення серотоніну синаптосомами діабетичних тварин, викликане ним підвищення загального моно-ADP-рибозилювання було нижчим у порівнянні з контролем (рис. 9). Недостатня ефективність токсину за діабету може пояснюватись тим, що моно-ADP-рибозилювання його білкових мішеней частково досягається внаслідок активації певних ендогенних моно-ADP-рибозилтрансфераз, які конкурують з холерним токсином за спільний субстрат – стимуляторну -субодиницю G-білків.

Таким чином, наведені результати засвідчують порушення G_s/cAMP/PKA-залежних механізмів контролю синаптичної функції за цукрового діабету. Підвищення рівня моно-ADP-рибозилювання, принаймні частково, може бути тим ендогенним механізмом, що активує опосередковані G_s-білками процеси фосфорилювання за діабету та може лежати в основі підвищеного як спонтанного, так і індукованого вивільнення серотоніну. Позитивна нейротропна дія NAm може реалізуватись через модуляцію досліджуваного сигнального шляху нервових закінчень шляхом інгібування процесів моно-ADP-рибозилювання білків.

В цілому, отримані дані підтверджують важливе фізіологічне значення специфічного зв’язування NAD⁺ синаптичними мембранами у функціонуванні серотонінергічної нейромедіаторної системи у нормі та за умов цукрового діабету. Механізм нейротропної дії вітаміну РР за ЦД1 полягає у нормалізації синаптичної активності на рівні NAD-модуляторної системи нервових закінчень, що може здійснюватись в результаті комбінації як прямих, так і опосередкованих через зниження інтенсивності оксидативного стресу та реакцій моно- і полі-ADP-рибозилювання білків ефектів вітаміну РР на цю систему.

ВИСНОВКИ

1. Приймаючи до уваги недостатню з’ясованість молекулярних механізмів біологічної, переважно некоферментної, дії вітаміну РР та його похідних у нервовій системі, проведені дослідження дозволили встановити важливу роль NAD-залежної модуляторної системи нервових закінчень та факторів, що визначають її функціонування, у контролюванні синаптичної активності за різних функціональних станів ЦНС.

2. Показано, що механізм нейромодуляторної дії NAD⁺ in vitro на процеси зворотного поглинання та вивільнення серотоніну синаптосомами головного мозку щурів пов’язаний з інгібуванням активності Na⁺,К⁺-АТРази та активацією потенціалкерованих натрієвих каналів. Продемонстровано можливість залучення сигнального шляху протеїнкінази C та аденілатциклазної системи до механізму реалізації нейромодуляторної дії NAD⁺.

3. Виявлено, що за за умов експериментальної діабетичної невропатії у відповідь на дію екзогенного NAD⁺ вивільнення серотоніну синаптосомами головного мозку знижується. Зростання специфічного зв’язування NAD⁺ синаптичними мембранами за цукрового діабету 1 типу корелює з направленістю порушень у зворотному поглинанні та вивільненні серотоніну нервовими закінченнями головного мозку, що підтверджує важливість NAD-опосередкованих мембранних процесів для нормального функціонування даної медіаторної системи. При цьому не було встановлено прямої залежності між рівнем NAD⁺ у головному мозку та його рецепцією синаптичними мембранами.

4. Вперше встановлено, що підвищення рівня моно-ADP-рибозилювання синаптосомальних білків та активація сигнального шляху G_s-білки/cAMP/протеїнкіназа A, принаймні частково, може бути ендогенним сигналом, здатним активізувати вивільнення нейромедіаторів за цукрового діабету.

5. Встановлено інтенсифікацію процесів пероксидного окислення ліпідів та істотне зниження активності основних ферментів антиоксидантного захисту клітин головного мозку за умов хронічної гіперглікемії, що спричинює порушення структурно-функціональної цілісності біологічних мембран та функціонування NAD-зв’язувальних ділянок синаптичних мембран головного мозку за діабету.

6. Вперше показано значне підвищення за діабету активності Parp та інтенсивності процесів полі-АDP-рибозилювання білків в клітинних ядрах головного мозку, пов’язане зі зростанням ступеню вільнорадикального пошкодження ДНК, що може призводити до часткового виснаження внутрішньоклітинних пулів NAD⁺ та АTP та відігравати роль у механізмі розвитку енергодефіциту в нервових клітинах.

7. Підтверджено важливість як коферментних, так і некоферментних функцій вітаміну РР та його похідних у нервовій системі за її різних функціональних станів. Показано, що нейротропна дія нікотинаміду та нікотиноїл-ГАМК за ЦД1 реалізується через нормалізацію функціонування NAD-модуляторної системи синаптичних мембран головного мозку, процесів моно- та полі-АDP-рибозилювання синаптосомальних та ядерних білків, сигнальних шляхів протеїнкінази А/C та системи антиоксидантного захисту.

СПИСОК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Т.М. Кучмеровская, З.Е. Столяров, Г.В. Донченко, И.А Шиманский, А.П. Клименко. Захват и высвобождение [2-¹⁴C]серотонина синаптосомами головного мозга крыс с экспериментальным диабетом: эффект ингибитора протеинкиназы С и экстракта из пищевого растения // Доп. НАН України. - 1999. - № 5. - С. 173-177.

2. Кучмеровская Т.М., Донченко Г.В., Шиманський И.А., Клименко А.П. Влияние никотинамидадениндинуклеотида на ионные каналы нервных окончаний головного мозга крыс // Доп. НАН України. – 2000. - № 3. - С. 188-192.

3. Т.М. Кучмеровська, І.О Шиманский, Л.В. Пакірбаєва, С.О. Михалюк Реалізація нейротропної дії вітаміну РР та його похідних за умов діабетичної нейропатії // Збірник наукових праць “Хімічні Науки (хімія та біохімія)”. -2000. - Вип. 1.- С. 62-66.

4. І.О. Шиманський, Т.М. Кучмеровська, Г.В. Донченко, М.М. Великий, А.П. Клименко, О.М. Паливода, М.О. Кучмеровський. Корекція нікотинамідом та нікотиноїл-ГАМК оксидативного стресу за діабетичної нейропатії // Укр. біохім. журн. – 2002. – Т. 74, № 5. – С. 89-95.

5. T. Kuchmerovska, I. Shymanskyy, G. Donchenko, L. Pakirbaieva, M. Kuchmerovskyy A. Klimenko. Poly -ADP- ribosylation enhancement in brain cells nuclei is associated with diabetic neuropathy // Journal of Diabetes and Its Complications. – 2004. - V. 18, N 4. - Р. 198-204.

6. І.О. Шиманський, Г.В. Донченко, А.П. Клименко Т.М. Кучмеровська. Механізми індукованих цукровим діабетом порушень процесу вивільнення серотоніну синаптосомами головного мозку щурів: ефект нікотинаміду // Укр. біохім. журн. – 2006. - Т. 78, № 4. - С. 130-136.

7. Kuchmerovskaya T., Donchenko G., Shimansky I., Pakirbaeva L. Effect of the inhibitors of PKC on serotoninergic transmission in streptozotocin-induced diabetes // 35^th An. Meeting of EASD. – Diabetologia, V.42, Suppl.1. – Brussels, Belgium, 1999. – P. A 12, 6.

8. Shymanskyy I., Kuchmerovska T., Donchenko G., Klimenko A. NAD-Receptor System in the mechanisms of nicotinamide action in diabetic encephalopathy // First (Inaugural) Ukrainian Congress for Cell Biology. - Lviv, Ukraine, 2004. - P. 386.

9. I. Shymanskyy, T. Kuchmerovska, A. Klimenko. The relation of diabetes-associated mono-ADP-ribosylation to impaired brain serotonin transmission: effect of nicotinamide // 40^th An. Meeting of the EASD. – Diabetologia, V.47, Suppl. 1. – Munich, Germany, 2004. – P. A 99, О. 256.

10. I. Shymanskyy, T. Kuchmerovska, G. Donchenko, A. Klimenko. Diabetes-associated cAMP/PKA-dependent facilitation of 5-HT release from rat brain synaptosomes: effect of nicotinamide // 41st EASD An. Meeting. – Diabetologia, V.48, Suppl. 1. - Athens, Greece, 2005. – A 426, 1181.

11. Kuchmerovska T, Shymanskyy I., Donchenko G., Klimenko A. Possible involvement of cyclic AMP system in nicotinamide adenine dinucleotide-induced serotonin release from rat brain synaptosomes // Укр. біохім. журн. – 2005. – Т. 77, № 2 (спец. випуск). - С. 64.

12. I. Shymanskyy, T. Kuchmerovska, G. Donchenko, A. Klimenko. Possible mechanisms of nicotinamide and nicotinoyl-GABA action in central nervous system of STZ-diabetic rats // 19^th World Diabetes Congress. – Diabetic Medicine, V.23. – Cape Town, South Africa, 2006. – P. 107-108.

АНОТАЦІЯ

Характеристики

Список файлов реферата