91900 (680298), страница 7
Текст из файла (страница 7)
Помимо импортных появились отечественные наборы для диагностики хламидийной инфекции реакцией прямой иммунофлюоресценции, которые практически не уступают по специфичности и чувствительности, но имеют значительно более низкую цену.
Материалом для исследования служат мазки-отпечатки, приготовленные с соблюдением правил. Мазки для РИФ готовятся на специальных деколированных стеклах в пределах ограниченной площадки диаметром 8 - 10 мм. После этого их высушивают на воздухе и фиксируют, погружая на 5 - 10 минут в холодный 96% (лучше абсолютный) этиловый спирт или нанося на препарат 0.1 - 0.15 мл охлажденного безводного ацетона до полного его испарения. Фиксированные препараты можно исследовать сразу или при необходимости хранить при комнатной температуре в течение суток или при -20°С в течение 2 недель (при этом необходимо исключить доступ влаги при хранении и доведении препарата до комнатной температуры перед исследованием при помощи полиэтиленового пакета и селикагеля).
При проведении прямой РИФ на препарат наносят раствор меченых антител в количестве, необходимом для полного покрытия мазка (25 - 30 мкл). Препарат инкубируют в горизонтальном положении во влажной камере в течение 15 минут при +37°С. Подсыхание реагента недопустимо во избежание ложноположительных результатов. Далее мазок промывают в проточной воде 30 сек, прополаскивают в дистиллированной воде, высушивают и готовят к микроскопии.
При проведении непрямой РИФ на препарат наносят необходимое количество раствора антихламидийных антител и проводят первую инкубацию в тех же условиях, что и при проведении прямой РИФ. Затем препарат промывают, высушивают на воздухе и наносят второй реагент - меченые антитела к хламидийным АТ и проводят вторую инкубацию так же во влажной камере при +37°С 15 минут. После промывания препарат высушивают и готовят к микроскопии. Готовые препараты рекомендуется просматривать сразу. При необходимости возможно хранение окрашенных препаратов в течение 1 - 2 суток при +2-8°С в темном месте без доступа влаги.
Микроскопию проводят с использованием иммерсионной системы. Возможны два варианта иммерсионной микроскопии:
1. Масляная иммерсия: На готовые высушенный препарат наносят 20 - 25 мкл монтирующей жидкости (глицерин, забуференный фосфатным буфером с рН 7.2 - 7.6), покрывают его обезжиренным покровным стеклом, на которое затем наносят каплю нефлюоресцерующего иммерсионного масла и микроскопируют объективом (маркировка “Л” - люминисцентный) с увеличением 90 и окуляром с увеличением 5.
2. Водная иммерсия: на готовый препарат наносят каплю 20 мкл фосфатного буфера с рН 7.4 и микроскопируют объективом для водной иммерсии (маркировка - белая полоса и “Л” - люминисцентный) с увеличением 60 и окуляром с увеличением 5. Водная иммерсия дает более ровное, яркое и четкое свечение.
РИФ позволяет выявлять антигенные структуры как элементарных, так и ретикулярных телец. ЭТ расположены преимущественно внеклеточно, округлой формы с ровными краями, мелкие (размер 1:100 - 1:150 по отношению к окружающим их клеткам), однородной структуры, имеют яркое специфическое изумрудно-зеленое свечение, которое при работе микровинтом может давать дифракционные кольца (кольца Дилекторского). РТ встречаются значительно реже, располагаются преимущественно внутриклеточно, имеют менее однородную структуру, более полиморфны, но также с четкими краями и обладают ярким специфическим изумрудно-зеленым свечением. Любой другой флюоресцирующий материал неправильной формы, неровными нечеткими краями, имеющий неяркую зеленую окраску, либо свечение другого цвета относится к артефактам. Интенсивность, яркость и оттенок специфического свечения зависит от рН монтирующей жидкости или буфера используемого для микроскопии. Большая интенсивность свечения ФИТЦ в щелочной среде увеличивает чувствительность метода, но ведет к увеличению числа объектов с неспецифическим свечением, а, следовательно, к ложноположительным результатам. В кислой среде интенсивность свечения ФИТЦ падает, что может дать ложноотрицательный результат. Сопутствующая микрофлора, а также ядра окружающих клеток неспецифически окрашиваются в различные оттенки оранжевого цвета бромистым индием, их цитоплазма - в различные оттенки кирпично-коричневого цвета синькой Эванса.
Для получения достоверного результата рекомендуется просматривать многие поля зрения препарата. Результат считается положительным в том случае, если препарат содержит клетки эпителия и удается обнаружить не менее 6 элементарных телец, имеющих все вышеперечисленные признаки.
Обнаружение меньшего количества возбудителя делает результат сомнительным и требует повторного исследования, желательно на фоне провокации (пищевая - алкоголь, медикаментозная - инъекция пирогенала, механическая - массаж уретры на буже). Контроль излеченности следует проводить не ранее чем через две недели, так как возможно сохранение не элиминированного антигенного материала нежизнеспособного возбудителя, что будет давать ложноположительные результаты. Получение 3 отрицательных результатов исследования у мужчин в течение месяца и у женщин в течение 3 менструальных циклов, отсутствие клинических проявлений хламидийной инфекции свидетельствует о выздоровлении.
РИФ при правильной подготовке пациента, соблюдении правил взятия материала и постановки реакции является высокочувствительным и специфичным методом диагностики урогенитального хламидиоза и позволяет выявлять возбудителя у 90 - 95% больных. Данный метод относительно дешев, прост в выполнении, высокоинформативен, не требует специального дорогостоящего оборудования, позволяет быстро получить результат (0.5 - 1 час) и визуально контролировать качество взятия материала для исследования.
Методы, использующие принципы молекулярной биологии
В группу входят методы ДНК-зондов и полимеразной цепной реакции (ПЦР), которые позволяют выявить генетический материал возбудителя в исследуемом биоматериале. Наборы для диагностики хламидиоза ДНК-зондами находятся пока на стадии разработки и клинических испытаний.
ПЦР активно внедряется в практику лабораторной диагностики. Метод основан на выделении специфической последовательности ДНК или РНК возбудителя при помощи комплементарных праймеров, последующего ее многократного копирования и накопления для дальнейшего выявления обычными методами детекции (электрофорез или ИФА). Данный метод обладает высокой специфичностью и чувствительностью, практически приближающейся к культуральному и позволяет обнаружить единичных возбудителей в исследуемом материале. Метод ПЦР требует специального дорогостоящего оборудования, отдельной специально оснащенной лаборатории, соответствующей подготовки и высокой квалификации медицинского персонала. Вместе с тем, отсутствие сертификации используемых в России праймеров и достаточного опыта применения метода ПЦР, специфичность исследуемого материала, частая его контаминация сопутствующей микрофлорой (что может давать ложноположительные результаты) не позволяет однозначно судить о его ценности при диагностике урогенитального хламидиоза.
Таким образом, в настоящее время наиболее доступным, простым и в то же время высокоинформативным методом диагностики урогенитального хламидиоза и установления излеченности является реакция прямой иммунофлюоресценции (РИФ). Контроль за динамикой течения заболевания и эффективностью лечения следует проводить, определяя титр антихламидийных антител в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа (ИФА).
4 Урогенитальный трихомониаз
Урогенитальный трихомониаз – широко распространенное инфекционное воспалительное заболевание, передаваемое преимущественно половым путем, вызывается простейшими Trichomonas vaginalis.
Трихомонады являются жгутиковыми эукариотами и относятся к простейшим из класса Flagellata, семейства Trichomonadida, рода Trichomonas. В человеческом организме паразитируют 3 вида трихомонад: Trichomonas intestinalis - кишечная трихомонада, Trichomonas elongata (tenax, buccalis) - ротовая трихомонада и Trichomonas vaginalis - влагалищная трихомонада. Только Tr. vaginalis поражает урогенитальный тракт и является патогенной для человека, вызывая воспалительные заболевания: уретрит, простатит, эндоцервицит, вагинит, бартолинит и т.д.
Биологические свойства Tr. vaginalis
Влагалищные трихомонады являются одноклеточными простейшими. Форма их вариабельна, чаще грушевидная - в нативных препаратах (висячая капля), но наряду с этим могут наблюдаться овальные, шарообразные, несколько удлиненные - веретенообразной формы. Длина тела влагалищной трихомонады колеблется от 5 до 30 мкм, ширина – 5 - 8 мкм. Она покрыта оболочкой - пелликулой. Тело влагалищной трихомонады состоит из цитоплазмы, ядра, парабазального тела, блефаропласта, ризопласта, аксостиля, ундулирующей мембраны, краевой и парабазальной фибриллы и жгутиков. Цитоплазма состоит из тонкозернистой массы. Ядро продолговато-овальной формы, расположено в передней трети тела. Впереди ядра, на переднем конце тела трихомонады, находится блефоропласт, от которого берут начало направляющиеся вперед 4 свободных жгутика. Они выполняют роль органоидов движения и принимают участие в захватывании пищи. Обнаружение жгутиков при просмотре нативных препаратов служит дифференциально-диагностическим признаком влагалищных трихомонад от других элементов материала (лейкоциты, эпителиальные клетки). Степень подвижности жгутиков отражает биологическую активность возбудителя. В окрашенных препаратах жгутики трудно различимы, что обусловлено их хрупкостью и повреждением при фиксации и окраске препарата.
Влагалищные трихомонады размножаются делением, как простым продольным делением на две части, так и множественным. Полный цикл деления занимает от 0.5 до 1.5 - 3 часов. Перед делением движение трихомонады замедляется, разделяется блефаробласт и жгутики, число которых удваивается. Далее делится ядро, дочерние ядра расходятся к противоположным полюсам. После перешнуровки цитоплазмы образуются две новые особи.
Трихомонады являются факультативными анаэробами. Оптимум роста наблюдается при +37°С. Они легко культивируются в питательных средах в присутствии или отсутствии других микроорганизмов.
Встречаются штаммы влагалищных трихомонад, которые авирулентны для их носителей и не вызывают у них видимых клинических реакций со стороны слизистых мочеполовых органов. Однако, при передаче их в процессе полового акта партнеру с переменой условий обитания они становятся патогенными и вызывают развитие воспалительного процесса в слизистой мочеполовых органов. Возможен переход асимптомной формы трихомониаза в манифестную при нарушении равновесия между макроорганизмом и влагалищной трихомонадой вследствие изменения реактивности организма, происходящим при инфекционных заболеваниях, переохлаждении, переутомлении, изменении гормонального статуса, при действии нервно-психических травм и других стрессорных факторов, приводящих к снижению как местной, так и общей иммуннорезистентности.
Инвазия влагалищной трихомонады способствует переходу постоянных сапрофитов уретры и влагалища у здоровых лиц в вирулентное состояние, что ведет к усилению токсигенного воздействия на ткани органов урогенитального тракта. В результате этого развивается смешанный трихомонадно-бактериальный воспалительный процесс, в котором первичным этиологическим агентом является Tr. vaginalis.
Вагинальные трихомонады способны фагоцитировать бактерии и другие частицы, которые затем перевариваются. Однако возможна персистенция бактерий (гонококков) внутри трихомонады, что способствует их длительному существованию в организме в скрытом, недоступном для антибактериальной терапии состоянии.
Влагалищные трихомонады могут сохранять жизнеспособность в неразведенных выделениях или в культурах, разведенных физиологическим раствором, или в других солевых растворах в течение нескольких часов, однако они плохо переносят гипотонические растворы, а высушивание и температура свыше 45°С убивает их мгновенно.
4.2 Лабораторная диагностика
Для обнаружения Tr. vaginalis используют следующие основные методы:
1. Микроскопия нативных препаратов;
2. Микроскопия окрашенных препаратов;
3. Культуральный метод;
4. Иммунологический метод.
4.2.1 Микроскопия нативных препаратов
При микроскопии нативных препаратов, возбудителя обнаруживают по его специфическому движению среди клеточных элементов и микроорганизмов в препарате, приготовленном непосредственно перед исследованием. Просмотр влагалищной трихомонады в нативных препаратах проводят методом раздавленной капли - “капли-суспензии” и реже методом “висячей” капли.
При приготовлении препарата “капли-суспензии” на сухое, обезжиренное и предварительно прогретое до 37°С предметное стекло наносят каплю теплого физиологического раствора хлорида натрия и смешивают в нем исследуемое отделяемое из очага заболевания (теплый физиологический раствор активирует влагалищную трихомонаду и увеличивает ее подвижность). Взвесь накрывают покровным стеклом, избегая образования воздушных пузырьков в препарате. Избыток жидкости, вышедшей за границы покровного стекла удаляют фильтровальной бумагой. Смывы со слизистой уретры, влагалища и негустые осадки центрифугатов, полученных на физиологическом растворе, а также культуры трихомонад, выделенные на жидких средах исследуются в нативных препаратах без дополнительного разведения.
При приготовлении препарата “висячая капля” на середину покровного стекла, края которого предварительно смазываются вазелином, наносится теплый (37 - 38°С) физиологический раствор, к которому добавляется исследуемый материал, осторожно перемешивается. Покровное стекло переворачивают и накладывают каплей вниз над лункой специального предметного стекла для просмотра “висячей капли”. Капля должна свободно свисать в углублении предметного стекла, не соприкасаясь с его краями и дном.
Ввиду того, что при длительном пребывании препаратов при комнатной температуре трихомонады теряют подвижность, исследование следует проводить возможно быстрее после получения материала (в течение не более 1 часа).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
