91900 (680298), страница 3

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 3)

Техника постановки. Предварительно для реакции разводят все ингредиенты. На дно центрифужной пробирки микропипеткой наливают 0,05 мл испытуемой сыворотки, добавляют 0,35 мл смеси комплемента (0,05 мл) с антигеном (0,3 мл). Пробирки энергично встряхивают в течение 30 сек. и оставляют при комнатной температуре на 30 мин; затем во все пробирки добавляют по 0,1 мл взвеси эритроцитов, пробирки энергично встряхивают в течение 30 сек. и оставляют в термостате при +37°С на 30 мин, после чего все пробирки центрифугируют при 1000 об/мин в течение 3 мин.

Учет результатов проводят путем подсчета бледных трепонем в надосадочной жидкости. Для этого 0,01 мл надосадочной жидкости микропипеткой наносят на предметное стекло, покрывают покровным стеклом и в темном поле зрения подсчитывают число бледных трепонем в 10 полях зрения. При просмотре препарата под микроскопом учитываются только те бледные трепонемы, которые могут свободно перемещаться с током жидкости. Те же трепонемы, которые попали в поле зрения с током жидкости дополнительно, после начала подсчета («приплывшие»), в этом поле зрения уже не учитываются. Процент прилипания бледных трепонем исчисляется по формуле:

(100 – О_n) /K * 100,

где O_n – число бледных трепонем в 10 полях зрения из опытной пробирки;

К – число бледных трепонем в 10 полях зрения из контрольной пробирки.

При иммунном прилипании бледных трепонем, равном 0 - 20%, результат расценивается как отрицательный; 21 - 30% - сомнительный; 31 - 50% - слабоположительный и при 51 - 100% - положительный.

В ответе результат реакции выписывается без указания процента. В случае несовпадения результатов РИП с данными других реакций необходимо провести повторный учет результатов РИП с вновь приготовленным препаратом, повторить постановку реакции с этой же сывороткой крови, при необходимости повторить РИП с сывороткой крови, взятой у обследуемого повторно.

РИП следует применять в следующих случаях: при диагностике тех форм сифилиса, когда на основании данных анамнеза, клиники, результатов КСР и других исследований не удается подтвердить диагноз заболевания; при дифференцировании неспецифических результатов КСР; при контрольном наблюдении после окончания лечения. Специфичность и чувствительность РИП близки РИБТ и РИФ.

1. Реакция гемагглютинации с бледными трепонемами (ТРПГА)

Принцип метода заключается в следующем: формалинизированные тонизированные бараньи эритроциты соединяются с экстрактом из патогенных бледных трепонем. Образующийся комплекс, который фиксируется на эритроцитах, составляет корпускулярный антиген. При соединении антигена с сывороткой, содержащей гомологичные антитела, образуется иммунный комплекс, который вызывает агглютинацию эритроцитов.

Предварительный результат может быть зарегистрирован после инкубации в течение 3 - 4 ч. Появление равномерной розовой окраски указывает на положительный результат, а агглютинат (преципитат) темно-красного цвета в виде пятна или кольца является показателем осаждения эритроцитов. ТРПГА-тест, выполняемый вручную или автоматизированным методом, является специфичным и чувствительным тестом.

1. Реакция микрогемагглютинации с бледными трепонемами (МНА‑ТР)

Является вариантом ТРПГА. Ее ставят на пластинках для микротитрования. Она требует по сравнению с ТРПГА меньшего количества сыворотки, адсорбирующего разбавителя и антигена. Окончательный результат получают после 4 ч инкубирования сыворотки. Автоматизированная реакция микрогемагглютинации с бледными трепонемами (АМНА-ТР) благодаря автоматизации процессов заполнения тест-пластин и разведения сыворотки проще и обходится дешевле, чем реакция АМН-ТР. Пригодна при массовых обследованиях на сифилис.

Клиническая оценка результатов серологических реакций

При первичном серонегативном периоде сифилиса бывают положительными РИФ и реакция Колмера как наиболее чувствительные серореакции. Однако это не является основанием для постановки таким больным диагноза первичного серопозитивного сифилиса. У ряда больных в этом периоде бывает изолированный положительный результат при постановке реакции Вассермана с трепонемными или с кардиолипиновым антигенами. В конце 3-й или в течение 4-й недели после появления первичной сифиломы становятся положительными стандартные серологические реакции - с этого момента начинается первичный серопозитивный период сифилиса. На 1 – 2-й неделе первичного серопозитивного сифилиса отмечается увеличение степени позитивности серореакции (1+, 2+, 3+) и нарастание титра реагинов (1:5, 1:10, 1:20). РИФ и реакция Колмера у всех больных дают резко положительный результат, но РИБТ отрицательная или процент иммобилизации очень низок. Диагноз первичного серопозитивного сифилиса ставится тем больным, у которых осадочные реакции и реакция Вассермана с неспецифическими антигенами дали однократный слабоположительный результат. При дальнейшем течении первичного сифилиса все серологические реакции становятся резко положительными (4+); титр реагинов достигает 1:80, 1:160, РИФ продолжает быть резко положительной, но РИБТ у большинства больных еще остается отрицательной или может стать слабоположительной.

При вторичном свежем сифилисе резко положительный результат по всем стандартным серологическим реакциям наблюдается почти в 100% наблюдений; титр реагинов наиболее высок - 1:160; 1:240 или 1:320. РИФ - 4+; РИБТ дает положительнй результат более чем у половины больных, однако процент иммобилизации трепонем невысок (40 - 60%).

При вторичном рецидивном сифилисе положительный результат по стандартным серологическим реакциям отмечается в 96 - 98%. Отрицательные результаты объясняются малосимптомным рецидивным течением, наличием астенизации, сочетанием сифилиса и ВИЧ-инфекции. РИБТ дает положительный результат у 85 - 90% больных при выраженной степени иммобилизации: 80 – 90 - 100%.

Третичный сифилис характеризуется положительными результатами по стандартным серологическим реакциям в 50 - 90% наблюдений и положительной РИБТ у 92 - 100% пациентов с высоким процентом иммобилизации.

Диагноз скрытого серопозитивного сифилиса устанавливают только по положительным серореакциям в крови с обязательным подтверждением их по РИБТ, т.к. только РИБТ (в меньшей степени РИФ) позволяет отдифференцировать ложноположительные серореакции (даже с позитивностью в 2+ или 3+) от истинно положительных.

Разные формы сифилиса нервной системы и висцерального сифилиса имеют различную частоту и выразительность стандартных серореакции. Так, прогрессивный паралич в 100% случаев сопровождается резко положительными всеми стандартными серологическими реакциями. Сифилис сосудов мозга, спинная сухотка, сифилитическое поражение сердечнососудистой системы сопровождаются положительными серореакциями лишь в 40‑50‑60%. Однако РИБТ почти при всех перечисленных патологических состояниях дает резко положительный результат (90 - 100% иммобилизации).

При диагностировании врожденного сифилиса в первые 2 мес. после рождения стандартные серологические реакции у ребенка не определяют, т.к. они могут быть положительными за счет пассивной передачи реагинов через плаценту. По этой же причине не имеет значение и положительный результат РИБТ. Пассивно переданные от матери ребенку имобилизины самопроизвольно исчезают в течение 6 мес. после рождения. Если ребенок инфицируется незадолго до родов, то в этом случае РИБТ будет еще отрицательной, несмотря на наличие в организме ребенка сифилитической инфекции.

При врожденном сифилисе детей грудного возраста с активными проявлениями стандартные серореакции могут быть отрицательными в 1% наблюдений.

При врожденном сифилисе раннего детского возраста отрицательные стандартные серореакции варьируют от 15 до 20%, но в этих случаях РИБТ дает положительные данные у 90 - 98% детей.

При позднем врожденном сифилисе при наличии активных проявлений стандартные серореакции констатируются лишь у 70 - 80% обследованных, но РИБТ четко положительная у 100% больных с высоким титром иммобилизинов.

Современные усовершенствованные серореакции с использованием принципов иммуноферментных констант

Несмотря на значительное количество тестов для серодиагностики сифилиса, их высокую чувствительность и специфичность имеется ряд состояний при которых данные серодиагностики требуют проверки и дополнительных исследований. Например, у пациентов, полноценно леченных по поводу сифилиса, иногда длительное время остаются положительными серореакции. Это объясняется состоянием серорезистентности, которое до настоящего времени не получило научной трактовки. Затрудняется также дифференциальная диагностика неведомого сифилиса от рецидива процесса и реинфекции. С целью разработки информативных вариантов серореакции были использованы детали антителообразования у больных сифилисом, с предложением и исследованием вариантов серореакции: метод иммуноферментного анализа (ИФА), метод иммуноблоттинга (IgM‑серология), полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Иммуноферментный анализ

Широко используется для диагностики сифилиса. Принцип реакции заключается в соединении сифилитического антигена, сорбированного на поверхности твердофазного носителя, с антителом испытуемой сыворотки крови и выявления специфического комплекса антиген-антитело с помощью антивидовой иммунной сыворотки, меченной ферментом. Взаимодействие фермента с субстратом дает цветную реакцию, интенсивность которой зависит от количества связанных сывороточных антител.

Тест для выявления IgG - тест-ловушка использует в качестве антигена очищенные патогенные трепонемы. У больных с вторичным, ранним и поздним сифилисом и нейросифилисом и у реинфицированных пациентов чувствительность теста 100%. Тот же принцип ловушки для антител применен с целью определения сывороточных IgM.

Метод иммуноблоттинга

При проведении иммуноблоттинга трепонемы подвергаются электрофорезу с разделением белковых иммунодерминант на нитроцеллюлозе. Затем производится обработка разделенных точек исследуемой сыворотки и антителами к IgG либо IgM, меченными ферментами или радиоактивными веществами.

lgM‑серология.

При изучении антителообразования в организме больных сифилисом установлено, что первыми после заражения вырабатываются специфические IgM, выявляемые уже на 2-й нед. после заражения и достигающие максимальной концентрации в крови на 6 - 9 нед. Через 6 мес. после окончания терапии у большинства больных в крови они не определяются, На 4-й нед. после инфицирования организм начинает продуцировать специфические IgG. Этот вид иммуноглобулинов в наибольшем количестве определяется через 1 - 2 года после заражения. Заслуживает особого внимания то, что специфические IgM перестают вырабатываться при исчезновении из организма антигена, а секреция IgG продолжается клонами клеток памяти. Кроме того, крупные молекулы IgM не проходят через плаценту от матери к плоду, в связи с чем по их наличию у ребенка судят об его инфицировании бледной трепонемой.

Ввиду того, что концентрация в крови специфических IgM закономерно снижается после эффективного лечения, рост титра этих антител может служить вспомогательным признаком наличия рецидива заболевания или реинфекции.

Полимеразно цепная реакция (ПЦР)

Метод заключается в многократном увеличении (амплификации) количества ДНК выявляемого микроорганизма. Разработка вариантов ПЦР для диагностики сифилиса обусловлена недостаточностью стандартных тестов при раннем серонегативном, врожденном сифилисе и нейросифилисе. ПЦР является превосходным методом для диагностики сифилиса при небольшом количестве трепонем в исследуемом материале. Достоинством ПЦР является возможность автоматизации реакции путем заданного циклического температурного режима для определяемой за счет меченных праймеров цветной реакции. Остается невыясненным вопрос – отражает ли наличие трепонемной ДНК присутствие жизнеспособных трепонем или это могут быть остатки погибших микроорганизмов, содержащие способную к амплификации ДНК.

Применение ПЦР может иметь большое значение при диагностике врожденного сифилиса, нейросифилиса, первичного серонегативного сифилиса, а также у больных, у которых диагностика сифилиса с помощью обычных серологических реакций затруднена из-за инфицирования ВИЧ.

Исследование спинномозговой жидкости

Особое внимание уделяется исследованию спинномозговой жидкости для определения пораженности сифилисом нервной системы, как критерий качества лечения у лиц с патологическими изменениями в ликворе до начала лечения и как один из критериев излеченности больных.

Ликвор получают при люмбальной пункции. В пробирку собирают 7 - 8 мл (но не более 10 мл) ликвора. Это количество распределяют в две пробирки, одну из которых направляют в клиническую лабораторию, а другую – в серологическую.

В клинической лаборатории исследуют цитоз, содержание белка, глобулиновые реакции Панди и Нонне-Апельта. Минимальные патологические изменения в спинномозговой жидкости следующие: содержание белка, начиная с 0,4%, цитоз - 8 клеток в 1 мкл, глобулиновые реакции (реакция Нонне-Апельта++, реакция Панди+++; реакция Ланге - больше 2-х 2-ек в цифровом значении, положительная РВ). Показатели выше указанных, будучи изолированными, свидетельствуют о выраженных патологических изменениях в спинномозговой жидкости. Патологической считается также ликвор, в котором несколько показателей изменены соответственно данным минимальной патологии, а РВ положительна. Концентрация белка в ликворе свыше 400 мг/л и число клеток более 5000 на 1 л свидетельствуют о воспалительном процессе в ЦНС. Для обозначения позитивности глобулиновых реакций и РВ применяется система четырех плюсов; резко положительный результат (4+), положительный - 3+, слабоположительный - 2+ и сомнительный - 1+.

Характеристики

Список файлов реферата