ref-19249 (678087), страница 3
Текст из файла (страница 3)
1.4.2 Культуральное исследование
Служит важным звеном лабораторной диагностики трихомоноза у мужчин и женщин, особенно при распознавании атипичных форм паразитов и выявлении их у лиц, получавших противотрихомонадные препараты при трихомонадоносительстве. Разумеется, посевы необходимо проводить параллельно микроскопии нативных и окрашенных препаратов и повторять при отрицательных результатах.
Разноречивая оценка культурального метода диагностики трихомоноза связана, в первую очередь, с использованием нестандартных питательных сред, нередко обладающих низкими качествами. Достаточной чувствительностью обладает среда СКДС, разработанная В. Н. Бедновой. Среди импортных высоким качеством обладают также среды «Diamon», «Kupferberg», «Asani», а также тест – система «Трихомоно-Скрин» Дмитриева .
Метод выращивания трихомонад в бульонной культуре - "золотой стандарт" для диагностики, потому что это простой в интерпретации метод и требует менее чем 300-500 трихомонад/мл инокулюма для начала роста в культуре. Тем не менее, для него существуют ограничения, присущие культуральным методам. Для диагностики необходим инкубационный период от 5 до 7 дней, являющийся слишком длительным из-за возможности инфицированного пациента к распространению инфекцию. В связи с этим он не получил широкого применения в клинической практике в качестве прямого диагностического метода.
Для улучшения восприятия культурального метода, за рубежом был разработан метод пластикового конверта, с помощью которого можно выполнить как немедленную проверку присутствия трихомонады, так и сохранить дальнейший рост трихомонад в одной самоподдерживающейся системе. Полученные результаты сравнимы с таковыми при исследовании мазка и культур. Аналогично пластиковому конверту используется система «InPouch» в виде двухкамерного мешка, позволяющая выполнить быструю проверку культуры путём микроскопии через стенку мешка.
Технология роста патогена на клеточной культуре использует свойства клеточных линий восстанавливать рост T.vaginalis из клинических образцов. Было продемонстрировано, что этот метод даёт лучшие результаты - относительно культивирования в бульоне и приготовления влажной камеры, поскольку способен определять T.vaginalis в концентрациях менее 3 организмов в 1 мл. Однако культивирование в культуре - это не простой рутинный метод; он дорог и неудобен для быстрой диагностики[5,9, 14,15,22,29,36,37]
1.4.3 Иммунологические методы
Ограничения культуральных и микроскопических методов для выявления T.vaginalis заставили учёных развивать альтернативные методы, которые могут определять антиген, антитело или нуклеиновые кислоты в уретральном или вагинальном экссудате. Иммунологические методы не получили должного распространения из-за отсутствия качественных отечественных тест-систем. Кроме этого, все методы серологической диагностики T.vaginalis мало информативны, т. к данный антиген не вызывает 100%-го иммунного ответа. Хотя для подтверждения диагноза ими можно воспользоваться. Используются различные методы определения антител: агглютинация, непрямая гемаглютинация, диффузия в геле, флюоресценция антител и иммуноферментный анализ, метод иммуноблотинга. Определённое диагностичическое значение имеет прямое определение специфических белков T.vaginalis в биопробах с использованием моноклональных антител в качестве быстрого метода диагностики трихомоноза. Прямой иммуноферментный и иммунофлюоресцентный анализ мазков вагинального соскоба (тест-система фирмы California Integrated Diagnostics, Benicia, Calif.), использующий перокидазо - и флюорохром - меченые смеси моноклональных антител к различным структурам T.vaginalis был таким же чувствительным и специфичным, как и используемый культуральный метод. К тому же результаты определения возбудителя трихомоноза получают в течение одного часа, что позволяет произвести экспресс-скрининг [10,17,35,41,42].
1.4.4 Методы генной диагностики T.vaginalis
С начала 90-х годов в лабораторную клиническую практику стали, внедрятся технологии определения видоспецифических нуклеотидных последовательностей областей ДНК (мишеней) бактерий и клеток высших организмов. Сначала это была ДНК-гибридизационная технология. В тест-системе Affirm VP используются синтетические зонды для выявления как Gardnerella vaginalis, так и T.vaginalis из одного вагинального соскоба. Данная методика лучше, чем метод влажной камеры. Тем не менее, встречались ложноотрицательные результаты при её сравнении с культуральным методом (80% чувствительности относительно положительных образцов в культуре). Одна из гибридизационных методик - “дот-блот” гибридизация, в которой использовался фрагмент 2,3 ДНК T.vaginalis в качестве зонда, могла определить ДНК T.vaginalis в вагинальном секрете. Однако нестабильность зонда, выполнение специфических технических приёмов, особенно использование радиоактивной метки, являлись большими недостатками этой методики. После того как радиоактивно меченный зонд заменили на флюоресцентно-меченный ДНК-зонд, эта методика сразу нашла своё применение при выявлении бессимптомного носительства T. vaginalis. Новая генодиагностическая технология - ПЦР, в последнее время опережает остальные методы генодиагностики трихомоноза и наравне с культуральным методом широко используется в клинической практике. Риу в 1999 г. предложили ПЦР методику идентификации ДНК влагалищной трихомонады с праймерами для амплификации повторяющегося фрагмента TV-E650. Сравнив свой метод с другими используемыми методиками диагностики: микроскопией нативного мазка, культуральным, а также с клиническими данными. Он считает, что предложенный метод ПЦР на 100% чувствителен и специфичен, т.к. не давал перекрёстной реакции с другими простейшими и Candida albicans. Использованная им методика ПЦР в два раза чаще выявляла трихомонаду, чем другие лабораторные методики. Японские учённые так же сумели подтвердить правомерность постановки диагноза “трихомониаз” в 19-ти случаях у женщин и в одном случае у мужчины методом ПЦР[43,44,45,46,48].
-
Лечение трихомоноза
Препарат выбора - метронидазол, или его аналог. Препарат назначают внутрь, внутривенно или внутривагинально. Эффективность химиотерапии достигает 80-95%. В последнее время чаще рекомендуется применять комплексную терапию, с использованием новейших препаратов, к примеру, таких, как Наксоджин. Кроме этого советуют проводить местную обработку слабыми дезинфекторами и растворами, снимающими воспаление. Причина данной терапии обусловлена адаптационными механизмами трихомонад. В силу чего сегодня редкий врач владеет методикой эффективного лечения этой патологии [1,2,18,25].
2.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Все исследования по теме квалификационной работы проводились на базе Одесского областного кожно-венерологического диспансера, расположенного по адресу: г. Одесса, ул. Воробьева, 5.
В исследовании, которое проходило в период с декабря 2003 года по май 2004 года, принимали участие исключительно мужчины в количестве 150 человек. Пациенты были обследованы на трихомоноз тремя методами: культуральным, микроскопии окрашенного мазка и ПЦР.
Всем обследуемым, за сутки до взятия материала производилась внутримышечная инъекция пирогенала, в дозе – 50 МПД, согласно инструкции приведенной [18]. Вследствие чего на момент анализа у 60% больных отмечались слизистые, слизисто – гнойные выделения.
2.1. Исследование культуральным методом.
Культуральный метод исследования заключался в посевах патологического материала (отделяемого уретры) на ИПС, по методике [21]. Использовалась питательная среда для выделения влагалищных трихомонад (Э).
Следующего состава, г/л:
ферментолизат биомассы микроорганизмов без оболочек
(осветлённый) 14,2
мальтоза 8,0
хлорид натрия 6,0
хлорид калия 0,1
карбонат натрия 1,2
РН среды доводился до 6,0 ± 0,2.
Препарат разработан ЦКВИ, выпускается НПО “ Питательные среды“.
Материал выделений и соскоб забираются ложечкой Фолькмана, если выделения обильные, то можно использовать бактериологическую петлю, при этом для увеличения отделяемого, левой рукой производится массаж уретры выжимающими приёмами (дистально-проксимальное направление). При посеве ложечка Фолькмана с посевным материалом опускается в среду до дна пробирки и энергично круговыми движениями смывается. Пробирка у спиртовки закрывается ватно-марлевой пробкой и ставится на инкубацию при 37 градусах Цельсия.
Учёт результатов проводился путём микроскопического исследования препаратов через 7 дней после посева. Осадок отбирался пастеровской пипеткой и микроскопировался в тёмном поле с увеличением 280. При положительном результате наблюдались движущиеся паразиты: одиночные или в скоплениях. Все препараты смотрелись нативными.
2.2. Исследование методом микроскопии мазка.
Метод микроскопии мазка основан на анализе соскоба или выделений, с последующей их окраской, методика[39]. Соскоб берется желобоватым зондом или тупой ложечкой из уретры. Из ложечки биологический материал извлекался копьём для перфорации кожного покрова. Выделения брались мазком – отпечатком.
Стекла обрабатывались так же, как и посуда, бывшая в употреблении, мылись и кипятились 15 минут в 0,5% мыльном растворе, затем многократно ополаскивались в горячей воде и не менее 5 раз в дистиллированной. После этого сушились в сухожаровом шкафу. Далее натирались между двумя дощечками с прикреплённой тканью и помещались до опыта в смесь спирта с эфиром 1:1. (Чистота стёкол в подобной диагностике имеет важное значение!)
Отобранный материал эмульгировался (очень нежно) на предметном стекле, после чего высушивался на воздухе 20-30 минут, затем окрашивался – 1% раствором метиленового синего, в течении 3 минут. В положительных случаях, обнаруживались трихомонады различной формы. Не больше одной в поле зрения.
Ядро окрашивалось в темно – синий, а протоплазма – в бледно-синий цвет. Трихомонады имели: овальную, круглую и грушевидную формы. Препарат смотрелся при увеличении 630 с иммерсионным объективом.
2.3 Исследование методом ПЦР
Для ПЦР – диагностики использовались соскобы уретры.
Все анализы на основе этого метода по группам больных проводились сотрудниками кафедры Кожных и венерических болезней Одесского Государственного Медицинского Университета.
Результаты обследованных были любезно предоставлены {XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX}! Простите этого человека не указываю!
3.РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В ходе проведения собственных исследований по сравнению различных методов диагностики трихомоноза у мужчин, общее количество которых составляло 150 человек, были получены следующие результаты: наиболее удачным методом диагностики трихомоноза является метод микроскопии окрашенного мазка. Его информативность составила 71%. За ним следует метод ПЦР, (включающий в себя данные исследований по различным группам), он составил 26%. И наименее информативным, а, следовательно, менее надежным методом диагностики трихомоноза, оказался культуральный метод. Его информативность составила 3%. Полученные результаты отражены на рисунке 1.
Исходя из результатов исследований можно сделать следующие выводы: для экспресс – диагностики мочеполового трихомоноза наиболее удобно использовать метод микроскопии окрашенного препарата уретрального соскоба или окрашенного мазка выделений. Более надёжный результат будет при проведении предварительной провокации пирогеналом. В случае непереносимости препарата (больные с острыми лихорадочными заболеваниями, беременные, гипертоники, диабетики), его можно заменить определенной комбинацией продуктов раздражающих слизистую оболочку желудка.
Данный метод имеет, перед остальными способами диагностики, ряд преимуществ: относительно недорогой и простой в проведении, результат достигается по истечении короткого промежутка времени, не требует применения дорогого лабораторного оборудования и высокой квалификации персонала.
В отношении метода ПЦР – диагностики трихомоноза, можно отметить следующее: по своей информативности он сегодня ещё уступает методу микроскопии окрашенного мазка. Это обусловлено недостаточной степенью очистки ДНК – возбудителя от балластных компонентов биоптата. Весомым недостатком ПЦР метода являются, сложность постановки опыта, необходимость применения дорогого оборудования и высокая стоимость анализа.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
