CBRR4293 (677223), страница 38

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 38)

присутствовать только эти два фрагмента.

Концептуально близким к этому варианту является метод

получивший название "амплификация рефрактерной мутационной

системы"- amplification refractory mutation system - ARMS. В

основе метода лежит неспособность Taq1 термофильной полиме-

разы к амплификации фрагмента при наличии несоответствия

(mismatch) между матричной ДНК и 3'-концом одного из олигоп-

раймеров (Newton et al.,1989; Bottema et al.,1990 ). Суть

метода заключается в оновременном проведении двух ПЦР, для

каждой из которых одним из праймеров служит аллель-специфи-

ческая мутантная или нормальная олигонуклеотидная последова-

тельность, соответственно. При этом в качестве второго прай-

мера для проведения двух реакций выбирают одну и ту же оли-

гонуклеотидную последовательность, так что в обоих случаях

могут амплифицироваться участки ДНК одинаковой протяжен-

ности.Мутантный сайт в аллель-специфических праймерах распо-

ложен не в центре, а ближе к 3'-концу, и чаще всего занимает

предпоследнюю позицию. При определенных условиях, важнейшим

из которых является концентрация ионов магния в растворе,

наличие сайта негомологичного спаривания в 3'-области прай-

мера препятствует началу синтеза ДНК. Таким образом, при на-

личии мутации в исследуемой матричной ДНК амплифицированные

фрагменты образуются только в том случае, если в качестве

аллель-специфического праймера выбирается мутантная последо-

вательность, тогда как при использовании нормального олиго-

нуклеотидного праймера ПЦР блокируется (Рис.4.9.). Метод на-

шел широкое применение для детекции мутаций при фенилкетону-

рии, бета-талассемии, муковисцидозе, при типировании генов

HLA системы. Однако, сложности в подборе праймеров и в выбо-

ре оптимального режима ПЦР ограничивают широкое применение

этого метода. Вместе с тем, его несомненным преимуществом

является возможность применения полностью автоматического

сканирования.

Таким же преимуществом обладают и методы детекции

состояния гена, основанные на лигировании синтетических оли-

гонуклеотидных зондов- OLA (oligonucleotide ligation assay).

При проведении этих реакций специфические ДНК или РНК после-

довательности исследуют путем использования их в качестве

матрицы для ковалентного связывания двух пар олигонуклеотид-

ных зондов (Landegren,1993). ДНК-зонды для лигирования под-

бирают таким образом, чтобы они были полностью комплементар-

ны нормальному фрагменту ДНК в области локализации мутации,

причем сама нуклеотидная замена должна находиться на стыке

двух праймеров. Обычно в один из зондов вводят радиоактивную

или флюоресцентную метку, а другой - метят биотином. После

гибридизации при строго стандартных условиях синтезированные

олигонуклеотидные последовательности сшивают ДНК-лигазами из

термофильных микроорганизмов. Такие ферменты работают при

высоких температурах и сохраняют свою активность в условиях,

необходимых для проведения денатурации молекул ДНК. При на-

личии мутации в тестируемой молекуле ДНК на конце одного из

зондов образуется сайт некомплементарного спаривания, не-

посредственно примыкающий к месту лигирования. Наличие тер-

минального неспаренного основания в смежно расположенных

последовательностях ДНК-зондов резко снижает скорость лиги-

рования и при определенных условиях проведения реакции сшив-

ки между зондами в этом случае не происходит. Метод включает

несколько последовательных циклов гибридизации, лигирования

и денатурации. Начиная со второго цикла, матричной ДНК для

гибридизации зондов наряду с тестируемой пробой служат также

лигированные последовательности. В дальнейшем проводят

электрофоретический анализ меченых однонитевых фрагментов

ДНК. Система успешно апробирована на мутациях глобиновых ге-

нов при серповидно-клеточной анемии и на мутации delF508 при

муковисцидозе.

Универсальным методом детекции замен оснований является

метод аллель-специфических олигонуклеотидов - ASO, который

включает амплификацию фрагментов ДНК и последующую дот- или

слот-гибридизацию с мечеными аллель-специфическими олигонук-

леотидами (Reiss, 1991). Для этого синтезируют два типа оли-

гонуклеотидных последовательностей обычно размером 19 пар

оснований, в которых мутантный сайт занимает центральное по-

ложение. Каждый из этих олигонуклеотидных зондов комплемен-

тарен нормальному или мутантному вариантам ДНК, соот-

ветственно. Условия гибридизации подбирают таким образом,

чтобы дуплексы образовывались только при полной комплемен-

тарности гибридных пар. В этих условиях амплифицированные

фрагменты ДНК без мутации будут гибридизоваться только с

нормальным зондом, ДНК гомозигот по мутации - только с му-

тантным и ДНК гетерозигот - с обоими олигонуклеотидами

(Рис.4.10). Для уменьшения перекрестной аллель-специфической

гибридизации в реакционную смесь добавляют 30-кратный избы-

ток конкурентного немеченого олигонуклеотидного ДНК-зонда.

Разработаны удобные модификации метода ASO с использованием

аллель-специфических ДНК-зондов, меченых биотином или пе-

роксидазой хрена (Лебедева и др.,1994).

Наиболее быстрым, экономичным и удобным методом скани-

рования точечных мутаций является модифицированный вариант

ASO, так называемая гибридизационная система обратного

дот-блота (reverse dot-blot hybridisation system) (Saiki

et.al.,1989). Метод позволяет одновременно скринировать сра-

зу много точечных мутаций и доступен автоматизации

(Chebab, 1993). В этом случае проводят гибридизацию меченых

продуктов ПЦР, обычно представляющих собой отдельные экзоны,

с фиксированными на нейлоновых фильтрах аллель-специфически-

ми олигонуклеотидными зондами (ASO). Предварительную иммоби-

лизацию мутантных и нормальных ASO-зондов на мембранах осу-

ществляют за счет присоединения гомополимерных T-хвостов с

дезоксирибонуклеотид-трансферазой на конце. При этом олиго-

нуклеотидные последовательности остаются свободными и могут

участвовать в гибридизации с мечеными амплифицированными

фрагментами ДНК. После отмывки несвязавшихся молекул ДНК ра-

диоавтографические или цветные пятна на фильтрах становятся

заметными только в местах локализации олигонуклеотидов, пол-

ностью комплементарных тестируемой геномной ДНК. Реакцию,

обычно проводят в присутствии ионов тетра-алкиламмония,

уменьшающих зависимость температуры плавления от композиции

оснований. Это позволяет использовать одинаковые условия

гибридизации для различных олигонуклеотидов, то есть вести

поиск сразу нескольких типов мутаций, локализованных в одном

и том же экзоне гена. Данный метод положен в основу разра-

ботки специальных систем, предназначенных для одновременной

детекции наиболее распространенных мутаций в исследуемом ге-

не. Система представляет собой ленточный фильтр (стрип) с

нанесенными пятнами олигопраймеров, каждый из которых соот-

ветствует определенной мутации. Стрип помещают в раствор со

смесью тех меченых амплифицированных экзонов, которые могут

содержать тестируемые мутантные аллели и создают условия для

аллель-специфифческой гибридизации. Таким способом сканируют

одновренно 42 мутации, ответственные за серповидноклеточную

анеми, 34 мутации при муковисцидозе (Сhebab,1993)

Очень простой метод обнаружения и идентификации

описанных ранее мутаций в амплифицированных фрагментах ДНК

основан на анализе характера электрофоретического разделения

продуктов ПЦР в MDE-гидросвязывающих гелях в присутствии

высоких концентраций мочевины. Эти гели способствуют форми-

рованию гетеродуплексов в процессе электрофореза, причем

расположение дуплексов очень специфично для различных му-

тантных аллелей, локализованных в одном и том же амплифици-

рованном фрагменте. Это позволяет не только выявлять, но с

высокой степенью вероятности идентифицировать известные му-

тации. В мультиплексном варианте методики возможен одновре-

менный поиск мутаций в нескольких амплифицированных фрагмен-

тах. Простота и высокая скорость анализа способствуют разра-

ботке на основе разделения в MDE-гелях схем максимальной ав-

томатизации процесса поиска и идентификации известных мута-

ций у пациентов и гетерозиготных носителей мутаций

Итак, методы выявления мутаций довольно разнообразны и

постоянно совершенствуются. В первую очередь, молекулярному

анализу подвергают те гены, повреждения которых сопровожда-

ются развитием наиболее частых заболеваний. Исследования

проводят либо в семьях высокого риска, где уже имеются боль-

ные с тем или иным моногенным заболеванием с целью выявления

гетерозиготных носителей, либо непосредственно в популяциях,

где имеется большая выборка больных и можно предполагать

высокую частоту гетерозиготных носителей мутаций. При этом

выбор конкретных схем идентификации мутантных аллелей, за-

частую, определяется диагностическими возможностями лабора-

торий и стоимостью анализов. Особое внимание уделяют поиску

тех аллелей, которые встречаются в популяциях с высокой

частотой. Именно для таких мутаций разрабатывают более

простые и эффективные методы молекулярной диагностики, поз-

воляющие тестировать больных и проводить скрининг гетерози-

гот среди их родственников или среди определенных групп

населения.

Важнейшей характеристикой мутантного аллеля является

его корреляция с тяжестью течения заболевания, то есть фе-

нотипическое выражение мутации в гомозиготном и в гетерози-

готном состоянии, а также в компаунде с другими мутантными

аллелями того же гена. Для многих моногенных болезней обна-

ружено большое число аллелей, которые по своему клиническо-

му проявлению могут быть подразделены на различные группы,

от очень мягких, оказывающих незначительный повреждающий

эффект, до летальных или полулетальных, обусловливающих

смерть пациентов в раннем возрасте. Таким образом, молеку-

лярная диагностика мутаций может иметь определяющее значе-

ние для прогнозирования развития заболевания и выбора адек-

ватной тактики лечения. Подобные скринирующие программы в

настоящее время разработаны и успешно осуществляются во

многих странах для таких распространенных заболеваний как

серповидноклеточная анемия, муковисцидоз (Rene et

al.,1994). Реализация этих программ наряду с большой меди-

цинской пользой приносит и массу социальных проблем, неко-

торые из которых будут рассмотрены ниже.

ВВЕДЕНИЕ В МОЛЕКУЛЯРНУЮ ДИАГНОСТИКУ И ГЕНОТЕРАПИЮ

НАСЛЕДСТВЕННЫХ БОЛЕЗНЕЙ.

В.Н.Горбунова, В.С.Баранов

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. СТРУКТУРА И МЕТОДЫ АНАЛИЗА ДНК.

Раздел 1.1 Общие представления, центральная догма, гене-

тический код.

Раздел 1.2 Выделение ДНК, ее синтез и рестрикция.

Раздел 1.3 Блот-гибридизация по Саузерну, гибридизация

in situ.

Раздел 1.4 ДНК-зонды, клонирование, векторные системы.

Раздел 1.5 Геномные и к-ДНК-овые библиотеки генов, их

скрининг.

Раздел 1.6 Секвенирование последовательностей ДНК.

Раздел 1.7 Полимеразная цепная реакция.

ГЛАВА II. ГЕНОМ ЧЕЛОВЕКА, СТРУКТУРА ГЕНОВ.

Раздел 2.1 Определение генома и его основных элементов.

Раздел 2.2 Повторяющиеся последовательности ДНК.

Раздел 2.3 Мультигенные семейства, псевдогены, онкоге-

ны.

Раздел 2.4 Современное определение понятия "ген",

транскрипция, регуляторные элементы генов.

Раздел 2.5 Изменчивость генома, полиморфные сайты рест-

рикции, ПДРФ-анализ.

Раздел 2.6 Вариабильные микро- и минисателлитные ДНК.

Раздел 2.7 Мобильность генома, облигатные и факультатив-

ные элементы генома.

Раздел 2.8 Изохоры, метилирование, гиперчувствительные

сайты.

ГЛАВА III. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ КАРТЫ, ПОЗИЦИОННОЕ КЛОНИРОВАНИЕ.

Раздел 3.1 Классификация генетических карт, оценка

сцепления.

Раздел 3.2 Соматическая гибридизация, цитогенетический

анализ, картирование анонимных последова-

тельностей ДНК.

Раздел 3.3 Генетические индексные маркеры.

Раздел 3.4 Хромосом-срецифические библиотеки генов,

пульсирующий гель-электрофорез.

Раздел 3.5 Позиционное клонирование, прогулка и прыжки

по хромосоме, идентификация и изоляция ге-

нов.

Раздел 3.6 Каталог генов и генных болезней МакКьюсика.

Международная программа "Геном человека".

ГЛАВА IY. ТИПЫ И НОМЕНКЛАТУРА МУТАЦИЙ. МЕТОДЫ ДНК-

Характеристики

Список файлов реферата