CBRR4293 (677223), страница 36

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 36)

фланкирующих интронных областей, из которых и производят

подбор специфических олигопраймеров. Секвенирование интронов

представляет собой достаточно трудоемкую задачу, решенную

далеко не для всех клонированных генов. Таким образом, к ог-

раничениям этого подхода следует отнести необходимость

достаточно полной информации о структуре гена и о его пер-

вичной нуклеотидной последовательности. Кроме того, объектом

тестирования могут быть лишь сравнительно небольшие области

гена, отсюда для получения более полной информации необходи-

ма амплификация многих экзонов.

Стратегия идентификации мутаций может быть различной и,

в конечном счете, определяется тем, имеем ли мы дело с ранее

неизвестными мутациями, либо целью анализа является скрини-

рование уже известных мутаций. В первом случае обектом

исследования чаще всего служат клонированные или амплифици-

рованные кДНК-овые последовательности, тогда как при молеку-

лярной диагностике известных мутаций, как правило, анализи-

руют амплифицированные фрагменты геномной ДНК.

Раздел 4.5. Первичная идентификация точечных мутаций.

Любые типы мутаций могут быть обнаружены путем прямого

секвенирования мутантной кДНК или отдельных экзонов и часто

первичный поиск нарушений в кодирующих областях гена осу-

ществляют именно таким образом. Сам метод секвенирования уже

был рассматрен ранее ( см.Главу I,раздел 1.6). Для некоторых

генов, имеющих небольшие размеры, метод прямого секвенирова-

ния с успехом применяется как основной метод сканирования

мутаций. Так, в частности, особенно удобным оказалось его

применение для детекции мутаций в сравнительно небольших по

размеру генах, таких, например, как ген фактора IX свертыва-

ния крови (гемофилия В). Использование эктопической мРНК для

получения амплифицированных кДНК-овых фрагментов открывает

особенно широкие возможности для применения метода прямого

секвенирования.

Разработаные в последние годы модификации методов ПЦР

значительно облегчили секвенирование амплифицированных фраг-

ментов и повысили его эффективность. Так, в частности, пред-

ложен вариант ассиметричной ПЦР, когда при амплификации кон-

центрация одного из олигопраймеров в несколько десятков раз

превосходит концентрацию другого праймера, в результате чего

синтезируется преимущественно только одна, нужная для секве-

нирования цепочка ДНК. Для этой же цели (получения одноцепо-

чечной ДНК) предложено использование магнитных частиц с

фиксированным на их поверхности стрептавидином. При этом

один из праймеров для проведения ПЦР метится биотином. Затем

к продуктам амплификации добавляют магнитные частицы с при-

шитым стрептавидином. Благодаря прочному связыванию биотин -

стрептовидин, меченая биотином последовательность ДНК фикси-

руется на магнитных частицах. С помощью щелочного лизиса с

частиц удаляют вторую немеченую комплементарную последова-

тельность ДНК, которую и используют для секвенирования. Еще

в одном варианте амплификацию проводят в присутствии прайме-

ров, несущих сайт узнавания для фермента Т7 - РНК полимера-

зы. После амплификации в системе in vitro проводят

транскрипцию амплификата с помощью Т7-РНК полимеразы и обра-

зовавшуюся одноцепочечную РНК используют для секвенирования

- метод GAWTS (genome amplification with transcript

sequences).

Однако, в общем случае секвенирование полноразмерной

кДНК или всех экзонов для генотипирования мутаций у отдель-

ных пациентов достаточно трудоемко, дорого и требует много

времени. Поэтому на практике чаще проводят предварительный

отбор более простыми методами амплифицированных, а иногда

клонированных фрагментов ДНК, предположительно содержащих

мутации, а затем секвенируют только эти участки ДНК. Методы

поиска фрагментов ДНК, предположительно содержащих мутации,

основаны на сравнительном анализе мутантных и нормальных

последовательностей по целому ряду физических и химических

характеристик, которые в значительной степени варьируют в

зависимости от типа мутационного повреждения. Следует под-

черкнуть, что независимо от метода детекции мутации и прак-

тически независимо от её природы (замены нуклеотидов, деле-

ции, дупликации и пр.) точные молекулярные характеристики

каждой мутации могут быть получены только путем прямого сек-

венирования. При наличии в амплифицированном фрагменте из-

вестных сайтов рестрикции положение мутации может быть пред-

варительно уточнено. Для этого продукты амплификации разре-

зают соответствующей эндонуклеазой и исследуют более корот-

кие фрагменты.

Наиболее просто обнаруживаются мутации, изменяющие дли-

ну амплифицированных фрагментов, так как подобные нарушения

легко выявляются при электрофоретическом анализе. Так, про-

тяженные делеции, захватывающие целые экзоны, могут быть вы-

явлены по изменению длины рестрикционных фрагментов, гибри-

дизующихся со специфическими ДНК-зондами. Более простая и

эффективная методика выявления таких мутаций в генах, сцеп-

ленных с полом, основана на одновременной амплификации раз-

личных экзонов, наиболее часто вовлекаемых в подобные пе-

рестройки, так называемый мультиплексный вариант ПЦР. Разни-

ца в размерах и числе амплифицированных фрагментов позволяет

легко идентифицировать такие мутации на электрофорезе

(Рис.4.2). Особенно широко этот метод используется для иден-

тификации делеций в гене дистрофина, на долю которых прихо-

дится около 60% всех мутаций, приводящих к миодистрофии Дю-

шенна (см.Главу X). При отсутствии делеций все амплифициро-

ванные фрагменты после электрофоретического разделения и ок-

рашивания можно наблюдать в виде отдельных полос. Если в

исследуемой ДНК какие-то из экзонов делетированы, будут

отсутствовать и соответствующие им полосы на электрофорег-

рамме (Рис.4. 2). Выбирая специфические участки гена для ам-

плификации, можно оценить размер делеции с точностью до от-

дельных экзонов, а также определить ее внутригенную локали-

зацию.

Метод этот, однако, не обнаруживает подобные делеции,

находящиеся в гетерозиготном состоянии или локализованные в

аутосомных генах, так как нормальная гомологичная последова-

тельность геномной ДНК может служить матрицей для амплифика-

ции любых фрагментов. Данный подход применим к анализу деле-

ций в аутосомных генах только в тех случаях, когда возможно

дополнить ПЦР количественной оценкой результатов амплифика-

ции - так называемая количественная ПЦР. Оригинальный метод

идентификации подобных делеций у гетерозигот основан на

использовании в качестве матричной ДНК для ПЦР кДНК, полу-

ченной путем обратной транскрипции из эктопической мРНК или

из мРНК, изолированной из экспрессирующих данный ген тканей

или культур клеток пациента. В отличие от нормального гомо-

лога, в мутантной молекуле кДНК граничащие с делецией экзоны

сближены. Если в качестве олигопраймеров для ПЦР будут выб-

раны последовательности из этих областей гена, только му-

тантная кДНК будет служить матрицей для амплификации неболь-

шого участка между праймерами из фланкирующих делецию экзо-

нов. В нормальной последовательности кДНК этот участок может

быть слишком велик, для того чтобы прошла амплификация.

Практически, для обнаружения гетерозигот по протяженным

внутригенным делециям проводят мультиплексную ПЦР с исполь-

зованием системы олигопраймеров, обеспечивающих амплификацию

фрагментов, полностью перекрывающих всю молекулу кДНК. Нали-

чие делеции регистрируют по появлению продуктов амплификации

необычного размера.

Небольшие делеции и вставки нуклеотидов не приводят к

отсутствию амплифицированных фрагментов ДНК, но изменяют их

размеры. Эти изменения могут быть зарегистрированы при

электрофорезе продуктов амплификации в полиакриламидном или

агарозном гелях (Рис.4.3). Именно этот метод используется

для детекции наиболее часто встречающейся мутации в гене му-

ковисцидоза - делеции трех нуклеотидов ^F508. После выявле-

ния различий между нормальной и мутантной ДНК по длине рест-

рикционных или амплифицированых фрагментов гена необходимо

провести секвенирование необычного фрагмента, с целью опре-

деления изменений в первичной структуре мутантной ДНК после-

довательности по сравнению с нормальной.

При мутациях гена, представляющих собой замену одного

или нескольких нуклеотидов, длины амплифицированных фрагмен-

тов остаются постоянными, однако, некоторые физико-хими-

ческие свойства мутантных молекул ДНК меняются. Так, напри-

мер, при гибридизации однонитевых ДНК, комплементарных нор-

мальной и мутантной нитям ДНК, возникают структурные наруше-

ния в месте негомологичного спаривания. С учетом этих осо-

бенностей разработаны различные варианты поиска мутантных

фрагментов ДНК и идентификации в них точечных мутаций. Веду-

щими из этих методов являются: метод анализа конформационно-

го полиморфизма однонитевой ДНК - SSCP, денатурирующий гра-

диентный гель-электрофорез - DGGE, метод химического расщеп-

ления некомплементарных сайтов (CMC), метод гетеродуплексно-

го анализа (HA) и, наконец, собственно метод секвенирования

Основные характеристики этих методов приведены в Табл.4.3

Таблица 4.3. Преимущества и недостатки основных методов пер-

вичной идентификации мутаций.

-------T---------T--------T------------T----------------¬

¦метод ¦ размер ¦ %% ¦ точность ¦ сканирование ¦

¦ ¦фрагмента¦детекции¦картирования+---------T------+

¦ ¦ (п.о.) ¦мутаций ¦ мутации ¦ экзонов ¦ кДНК ¦

¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

+------+---------+--------+------------+---------+------+

¦SSCP ¦ 250 ¦ 80% ¦ нет ¦ +++ ¦ + ¦

¦DGGE ¦ 600 ¦ 95% ¦ нет ¦ ++ ¦ ++ ¦

¦СМС ¦ 1700 ¦>95% ¦ да ¦ + ¦ +++ ¦

¦PCR DS¦ 500 ¦>99% ¦ да ¦ ++ ¦ ++ ¦

¦НА ¦ 300 ¦ 80% ¦ нет ¦ ++ ¦ + ¦

L------+---------+--------+------------+---------+-------

"+" - применимость метода для сканирования геномной ДНК и

кДНК

SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) - метод

анализа конформационного полиморфизма однонитевой ДНК, пред-

ложенный (Оrita et al.1989, Сlavac, Dean, 1993) основан на

регистрации различий в электрофоретической подвижности одно-

нитевых ДНК, одинаковых по величине, но различающихся

вследствие нуклеотидных замен по пространственной организа-

ции молекул (Рис 4.4). Скручивание или конформация небольших

однонитевых ДНК существенно зависит от их нуклеотидной

последовательности, так что замена даже одного основания в

молекулах одинакового размера приводит к изменению их прост-

ранственной структуры. Метод включает амплификацию специфи-

ческих сегментов ДНК размером от 50 до 300 пар оснований,

обычно в присутствии меченых трифосфатов, денатурацию обра-

зовавшихся продуктов ПЦР и нативный высокоразрешающий элек-

рофорез в полиакриламидном геле. Иногда амплификацию прово-

дят без использования метки, но тогда для лучшего разделения

ДНК и однозначной идентификации бэндов на электрофореграмме

используют специальные гели - Hydrolink либо MDE (AT

Biochem,USA), а также более чувствительные по сравнению с

этидиумом бромидом методы окрашивания, такие как окраска се-

ребром. На процесс конформации оказывают влияние различные

внешние факторы - температура, концентрация акриламида и

глицерина в геле, ионная сила буферных растворов

(Сlavac,Dean,1993). Оптимальный подбор этих параметров поз-

воляет эффективно разделять амплифицированные фрагменты ДНК,

различающиеся даже всего на один нуклеотид. Конформационный

Характеристики

Список файлов реферата