11019 (646834), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Фаговые векторы. Инфицированные клетки высевают на газоне чувствительных клеток, на котором в результате инфицирования соседних клеток образуются фаговые бляшки. Некоторые векторные системы имеют встроенные маркеры, позволяющие легко отбирать рекомбинанты среди реконструированных интактных векторов.
Векторы, сконструированные на основе вирусов животных. Трансдуцирующие 8У40-векторы, способные продуцировать вирусные частицы, клонируются так же, как и фаговые векторы. Однако, поскольку такие 8У40-векторы нуждаются в вирусе-помощнике, восполняющем утраченные ими функции, вирусные бляшки могут содержать как рекомбинантные геномы, так и геномы помощника. Плазмида, сконструированная на основе вируса SV40, и пассивно трансформирующие векторы, которые не продуцируют вирусных частиц, сначала клонируют как челночные векторы в клетках Е. coli. Обычно они содержат селективный маркер, определяющий фенотип животной клетки, что позволяет отобрать клоны трансформированных клеток. Аналогично рекомбинантные векторы на основе папилломавирусов крупного рогатого скота и ретровирусов клонируют в клетках Е. coli как челночные векторы, а затем трансфицируют ими клетки животных.
Скрининг клонированных популяций рекомбинантных молекул
а. Обнаружение нужного клона
После разделения рекомбинантных молекул и получения отдельных клонов встает трудно разрешимая задача-обнаружение нужного клона или клонов. Идентификация клона основывается на том, что вставка в рекомбинантной ДНК детерминирует какое-то уникальное свойство содержащей ее клетки. Это свойство может определяться структурой самой вставки либо быть связанным с ее функцией. На нем основывается скрининг популяции клонов с целью идентификации одного нужного клона. Методы скрининга должны быть очень чувствительными, поскольку иногда приходится идентифицировать один клон из сотен тысяч или даже миллионов клонов.
б. Отжиг с комплементарным полинуклеотидом
Комплементарные одноцепочечные полинуклеотиды, будь то РНК или ДНК, при соответствующих условиях с легкостью ренатурируют, несмотря на присутствие большого избытка неродственных цепей. Благодаря этому исследователь получает мощный инструмент для обнаружения специфической вставки, который можно использовать в разных ситуациях.
Отжиг с радиоактивным зондом. Предположим, что мы имеем большую популяцию клонированных рекомбинантных молекул и проводим отжиг с определенным полинуклеотидным зондом. Тогда мечеными становятся только те рекомбинантные молекулы, которые содержат последовательности, комплементарные зонду. Успех эксперимента зависит прежде всего от наличия нужного зонда.
Для скрининга большого числа колоний, содержащих плазмиды, а также фаговых бляшек разработаны удобные и быстрые методы. На тех же принципах основан и скрининг 8У40-бляшек. Метод состоит в том, что бактериальные колонии или бляшки переносят с агара на иммобилизованную подложку, например на нитроцеллюлозный фильтр, и подвергают содержащуюся в них ДНК денатурации. Затем фильтр инкубируют в растворе, содержащем денатурированный 32Р-ме-ченный зонд, в условиях, способствующих ренатурации комплементарных цепей. Если колония или бляшка содержит ДНК, комплементарную зонду, то на радиоавтограмме в соответствующем месте будет наблюдаться потемнение. Несмотря на то что каждая бляшка или колония содержит лишь небольшое количество ДНК, ее удается выявить благодаря высокой удельной радиоактивности зондов.
Получить большие коллекции клонированных колоний или бляшек на нитроцеллюлозных фильтрах не составляет труда. Бактерии и дрожжи хорошо растут на самом нитроцеллюлозном фильтре, помещенном на соответствующий питательный агар. Фильтр, содержащий колонии, обрабатывают так, чтобы произошли лизис клеток и денатурация ДНК, отжигают денатурированную ДНК с зондом, идентифицируют бляшки, ДНК которых гибридизовалась, и отбирают клетки из соответствующего участка агара. Фаговые бляшки переносят на нитроцеллюлозный фильтр, наложив его на питательный агар. За один раз на фильтр может быть перенесено до 10000 бляшек с одной чашки диаметром 10 см. Если осторожно снять фильтр, то ДНК из каждой бляшки останется фиксированной на нем. После отжига и идентификации нужных бляшек можно отобрать фаговые частицы из бляшек, оставшихся на чашке с агаром.
Аналогичным образом можно выявить упакованные рекомбинантные молекулы вируса SV40. Питательный агар, покрывающий инфицированный монослой клеток обезьяны, удаляют, весь монослой переносят на нитроцеллюлозный фильтр и идентифицируют нужные бляшки путем отжига с соответствующим радиоактивно меченным зондом. Вирионы, содержащие рекомбинантные ДНК, отбирают из агарового слоя.
В качестве зондов можно использовать высоко очищенные мРНК и денатурированные гомологичные ДНК или кДНК. Особенно удобны одноцепочечные зонды, поскольку их не нужно денатурировать и тестируемые клонированные ДНК не конкурируют с другими гибридизующимися цепями ДНК во время отжига. мРНК-зонды уже являются одноцепочечными, а одноцепочечные кДНК-зонды легко получить, скопировав только одну цепь. Одноцепочечные РНК-зонды можно также приготовить из рекомбинантной плазмиды, содержащей последовательность зонда, встроенную в специальный вектор, например pGEM. Этот вектор содержит два разных высокоспецифичных бактериальных промотора, фланкирующих вставку в рекомбинантных молекулах. Используя очищенную соответствующим образом линеаризованную плазмиду в качестве матрицы in vitro и ту или иную из РНК-полимераз прокариот, синтезируют РНК, которая представляет собой копию одной из двух цепей вставки.
Если известна аминокислотная последовательность полипептида, кодируемого данным геном, то можно восстановить нуклеотидную последовательность этого гена и затем синтезировать его химическими методами. Даже в тех случаях, когда в качестве зонда используется участок ДНК длиной всего 15 нуклеотидов, можно получить относительно достоверный результат. Из-за вырожденности генетического кода невозможно точно восстановить уникальную последовательность кодирующего участка. Чтобы решить эту проблему, синтезируют смесь олигонуклеотидов, различающихся одним или несколькими нуклеотидами. Это не так трудно, как кажется. Вместо того чтобы использовать один защищенный мононуклеотид на определенном этапе химического синтеза, используют смесь защищенных мононуклеотидов.
Тестирование на синтез специфического полипептида in vitro. Иногда не удается провести прямой скрининг клонов потому, что просто отсутствует в достаточной степени очищенный подходящий зонд. В таком случае можно использовать непрямые методы, хотя обычно они неудобны при массовом скрининге клонированных популяций. Большинство обычно применяемых непрямых методов основаны на двух принципах. Во-первых, можно транслировать соответствующую мРНК in vitro и получить идентифицируемый полипептид. Во-вторых, можно использовать тот факт, что трансляция подавляется, если одноцепочечная мРНК ренатурирует с комплементарной клонированной ДНК. РНК, входящая в дуплекс РНК-ДНК, не способна функционировать как мРНК.
Если проинкубировать смесь мРНК in vitro в присутствии необходимых компонентов, то на них синтезируются соответствующие полипептиды. Смесь этих полипептидов можно разделить по размерам с помощью электрофореза. Эффективная трансляция in vitro осуществляется только с одноцепочечных мРНК. Если же до начала трансляции какая-то мРНК ренатурировала с комплементарной ДНК и образовался гибридный дуплекс ДНК-РНК, то информация с этой мРНК не будет считываться. С помощью процедуры, получившей название HART, клонированные рекомбинантные ДНК очищают, денатурируют и отжигают с препаратами мРНК до начала трансляции in vitro. Молекулы ДНК, гомологичные определенному гену, гибридизуются с мРНК, и среди продуктов трансляции не обнаруживается соответствующий полипептид.
Второй метод идентификации рекомбинантных молекул с помощью трансляции in vitro получил название гибридизационной селекции. Из популяции рекомбинантов выделяют и очищают рекомбинантные ДНК. Полученные препараты ДНК подвергают денатурации и каждый из них фиксируют на твердой подложке, например на нитроцеллюлозном фильтре. Каждый из препаратов инкубируют со смесью мРНК. Гибридизация и связывание РНК на фильтре происходят только в тех случаях, когда РНК оказывается комплементарной иммобилизованной клонированной ДНК. Все остальные РНК удаляются с фильтра при промывании. Связанную РНК отделяют от ДНК и тестируют на синтез специфического полипептида в системе трансляции in vitro. Это позволяет идентифицировать соответствующий рекомбинант.
Для облегчения идентификации полипептидов, образующихся при трансляции смеси мРНК in vitro, используют разные методы. Если препарат мРНК обогатить специфической мРНК, то полипептид, кодируемый такой мРНК, иногда удается идентифицировать среди продуктов трансляции по его размеру и количеству. Когда используется сложная смесь мРНК и полипептидов, интересующий нас полипептид можно идентифицировать по его способности взаимодействовать со специфическими антителами. В таких случаях применяют метод белкового блоттинга, аналогичный блоттингу ДНК. При другом подходе нужный полипептид осаждают в присутствии специфических антител из смеси продуктов трансляции in vitro, осадок растворяют и подвергают электрофорезу. В принципе в геле должны присутствовать только два белка - интересующий нас полипептид и иммуноглобулин.
в. Определение экспрессии гена в клетках
Экспрессирующийся ген, входящий в состав рекомбинантной ДНК, при определенных условиях придает клетке-хозяину специфические фенотипические свойства. Метод отбора, основанный на выявлении этого фенотипа, позволяет идентифицировать и выделять соответствующий клон точно так же, как стандартные селективные маркеры в векторных молекулах позволяют отбирать трансформированные клетки. К стандартным селективным маркерным системам, относятся клетки Е. coli, утратившие в-лактамазу, которые используются для отбора трансформантов, содержащих векторы с геном amp, а также клетки млекопитающих, имеющие фенотип ТК-, которые позволяют отобрать трансформанты, содержащие векторы с геном тимидинкиназы. С помощью фенотипического отбора можно отбирать специфические клоны непосредственно из популяций бактерий, дрожжевых или животных клеток, трансформированных смесью рекомбинантных векторов, содержащих различные гены бактерий, дрожжей или животных соответственно. Возможность проведения такого отбора зависит от наличия хозяйских клеток с определенным фенотипом, чаще всего клеток, дефектных в отношении продукта гена, который должен быть клонирован. Если отсутствуют нужные хозяйские клетки, то вместо фенотипического отбора можно использовать иммунологический скрининг. В таких случаях клоны отбирают с помощью антител, специфичных в отношении продукта данного гена.
Фенотипический отбор. Фенотипический отбор из популяции трансформированных клеток - это самый прямой путь выделения нужного клона. На практике этот метод, вообще говоря, ограничивается клонированием прокариотических генов и некоторых генов дрожжей и других грибов в клетках прокариот и эукариотических генов в клетках эукариот. Чтобы клонировать ген А, смесь фрагментов ДНК встраивали в векторные молекулы и трансфицировали ими клетки, мутантные по гену А. Клетки выращивали в условиях, требующих присутствия продукта гена А, так что колонии могли образовывать лишь те клетки, в которых синтезируется продукт гена А, присутствующего в векторе. Наиболее подходящими для проведения такого отбора являются клетки-хозяева, в которых делетирован либо весь ген А, либо его часть. В противном случае приходится выявлять и разграничивать ревертанты и трансформанты. Кроме того, делеционные мутанты исключают вероятность проявления фенотипа А+ в результате супрессии фенотипа А - какими-то другими генами.
Экспрессия эукариотических генов в бактериальных системах хозяин-вектор. Ни фенотипический отбор, ни иммунологический скрининг обычно неприменимы при выделении клеток Е. coli, содержащих определенный рекомбинантный эукариотический ген. Исключение составляют некоторые гены дрожжей и других грибов, способные экспрессироваться в клетках Е. coli. Однако большинство генов эукариот не могут должным образом экспресси-роваться в клетках Е. coli, поскольку они утратили функциональные промоторы и содержат некодирующие участки в составе кодирующих последовательностей. Другое дело, если рекомбинанты содержат кДНК-копии эукариотических мРНК, поскольку некодирующие участки выщепляются во время созревания мРНК в эукариотических клетках. Клетки Е. coli не способны осуществлять такой сплайсинг. В результате кДНК транслируются в правильные полипептиды в Е. coli. Для того чтобы клетки Е. coli смогли обеспечить транскрипцию и трансляцию клонированной эукариотической кДНК, в соответствующие сайты вектора обычно включают Е. сой'-промотор и сигналы трансляции. Подобным же образом, для того чтобы кДНК эукариот могла экспрессироваться в эукариотических клетках, вектор необходимо снабдить соответствующими сигналами регуляции транскрипции. Поскольку в норме геномные регуляторные сигналы обычно находятся вне транскрибируемой части гена, в 5' - или З'-фланкирующем участке, они отсутствуют в мРНК или кДНК.
Другие методы фенотипического скрининга в эукариотических клетках. Фенотипический скрининг редко применяется при работе с диплоидными эукариотическими клетками, поскольку для этого необходима линия клеток, у которых повреждены оба аллеля интересующего нас гена. Идентифицировать трансформированные клетки можно с помощью котрансформации, применяя селективный маркер и соответствующие мутантные клетки или доминантный маркер и клетки, ингибируемые антибиотиком. Однако при этом невозможно различить нужный котрансформант и сопутствующие контрансформированные колонии, содержащие разные рекомбинантные молекулы ДНК. Поэтому обычно скрининг основывается на использовании специфических свойств, проявляемых нужным клоном. В качестве примера можно привести морфологические изменения, наблюдаемые при превращении нормальных клеток в опухолевые, который описан в разделах, посвященных векторам на основе папилломавирусов крупного рогатого скота и ретровирусов. Клетки, трансформированные к онкогенному фенотипу, образуют характерную колонию, или фокус, в отличие от обычных клеток, образующих монослой. Этот метод использовали, например, при отборе рекомбинантов, содержащих клеточные онкогены из геномной ДНК животных.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
