~1 (645833), страница 3

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 3)

Одно из основных проявлений апоптоза на биохимическом уровне реализуется в ядре клетки и состоит в фрагментации ДНК. Сначала происходит образование крупных фрагментов ДНК, содержащих 700, 200-250, 50-70 тысяч пар оснований (т.п.о.), позже 30-50 т.п.о. Уже на этой стадии регистрируется конденсация хроматина и выпячивание ядерной мембраны, характерные для апоптоза. Полагают, что именно эти начальный этап фрагментации хроматина является ключевым событием апоптоза, после осуществления которого процесс становится необратимым [Погорелов В.М., Козинец Г.И.,1995].

Следующий этап фрагментации ДНК - ее межнуклеосомная деградация, т.е. расщепление в результате формирования разрывов (в основном двунитевых) между нуклеосомами с формированием фрагментов, содержащих 180-190 п.о. Именно эти фрагменты выявляются в виде “лесенки” при электрофорезе ДНК апоптотических клеток, который широко используется для идентификации апоптоза [Казанова Л.И.,1979; Marmur J.,1961].

Деградация хроматина при апоптозе является активным процессом, она зависит от температуры, требует синтеза РНК и белка de novo. Осуществление различных этапов деградации ДНК связывают с проявлением активности разных ферментов. Считают, что межнуклеосомная деградация при апоптозе обусловлена активацией резидентной ядерной Са^2Мg^2зависимой эндонуклеазы [Исаева М.П. и соавт.,1998]. Выделена эндонуклеаза с молекулярной массой 18 кД. Мало сведений о ферментах, обеспечивающих появление крупных разрывов ДНК. По одним сведениям, они не зависят от Са²⁺ (хотя и зависят от Мg²⁺), по другим данным, формирование крупных фрагментов ДНК так же зависит от Са²⁺. Феномен апоптоза неоднороден и при действии различных его индукторов, события, по крайней мере до определенного этапа, могут развиваться по разнообразным сценариям, и лишь достигнув определенной точки конвергенции, различные пути сходятся, а механизмы реализации гибели оказываются идентичными. К ключевым дистальным механизмам реализации апоптоза относят активацию цистеиновых и сериновых протеиназ. Ингибиторы сериновых протеиназ подавляют апоптоз, индуцированный глюкокортикоидами [Bnuin de P.S. e.a.,1995; Garrido F. e.a.,1995].

Наблюдаемые при апоптозе уплотнение и деформация наружной и внутриклеточной мембран, формирование устойчивого к действию детергенов покрова, сморщивание цитоплазматических гранул связывают с перекрестным сшиванием белков, обусловленным активацией Са²-зависимой трансглутаминазы типа II, что служит обязательным и характерным биохимическим признаком апоптоза. Непосредственной причиной гибели клеток при апоптозе, вероятно, служит истощение пула АТФ, являющееся следствием активации поли (ADP- рибоза)полимеразы в ответ на повреждение ДНК [Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В.,1996; Marmur J.,1961].

1.3.3. Распознавание апоптотирующей клетки макрофагами

К настоящему времени расшифровано три механизма, с помощью которых макрофаги распознают клетки, подвергающиеся апоптозу, и удаляют их.

Распознавание, а следовательно и адгезия макрофагов к клеткам, вступившим на путь апоптоза, почти полностью блокируется при добавлении в среду N-ацетилгалактозамина и галактозы. Из этого следует, что ранним мембранным проявлением апоптоза является специфическая перестройка углеводных компонентов мембраны с потерей сиаловых кислот, наружной экспрессией сахаров и снижением общего отрицательного потенциала наружной поверхности мембраны. Потеря терминальных сиаловых кислот с боковых цепей мембранных гликопротеидов влечет за собой то, что экранированные в обычных условиях ацетилглюкозамин, N-ацетилгалактозамин и галактоза приобретают возможность взаимодействовать с лектинами макрофагов [Taga H. e. a. , 1994]

Другой тип распознавания апоптотирующих клеток осуществляется с помощью макрофагального 43 интегринового рецептора. Тромбоспондин, синтезируемый и выбрасываемый в микроокружение макрофагами, выполняет роль молекулярной скрепки между апоптотирующей клеткой и макрофагом. Существенную роль в этом процессе играет мембранный мономер 88кД, больше известный как CD36. Третий механизм распознавания клеток, вступивших на путь апоптоза, состоит в том, что на самых ранних этапах программированной гибели клеток, еще до формирования апоптотических телец, происходит инверсия мембранных фосфолипидов. В обычных условиях наружный лепесток мембранного бислоя содержит, в основном, нейтральные фосфолипиды, сфингомиелин и фосфатидилхолин, в то время как отрицательно заряженные фосфолипиды структурированы на внутреннем лепестке мембранного бислоя. У апоптотирующих клеток эта мембранная асимметрия нарушается, и они экспрессируют наружу фосфатидсерин, который распознается специфическим макрофагальным рецептором [Taga H. e. a., 1994; T. Uehara e. a., 1992].

Следует отметить, что тип распознавания апоптотирующих клеток макрофагами может сильно зависеть от типа клеток и от стадии процесса программированной гибели [Исаева М.П. и соавт.,1998].

1.3.4. Гены, участвующие в апоптозе

Некоторые гены важны для программирования клеток к гибели, другие необходимы для окончательного удаления мертвых клеток и, наконец, четыре гена непосредственно участвуют в процессе апоптоза [Akbar A. N. e. a., 1993].

Продукт гена nuc-1 является эндонуклеазой, расщепляющей ДНК в мертвых клетках. Клетки с мутацией в nuc-1 погибают без деградации ядерной ДНК. Неизвестно существует ли сходство между продуктом nuc-1 и Са^2Мg^2зависимой нуклеазой [Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В.,1996; Marmur J.,1961].

Два гена- ced-3 и ced-4- необходимы для клеточной гибели. При мутациях в этих генах клетки, обычно запрограммированные на гибель, выживают. Показано, что ced-3 является протеазой, а ced-4 содержит Са^2Мg²связывающий домен. ced-9 кодирует белок, предотвращающий гибель клеток, индуцированную ced-3 и ced-4 [Akbar A. N. e. a., 1993,].

1.3.5. Необходимость изучения апоптоза

Отметим ряд наиболее важных для фармакологии направлений для изучения апоптоза.

Во-первых, поиск и разработка препаратов, угнетающих апоптоз. Клиническую перспективность могут иметь препараты, блокирующие апоптоз, индуцированный некоторыми вирусами и суперантигенами. Очевидно, что такие антиапоптотические препараты будут представлять собой первый класс иммуностимуляторов. Теоретически, ингибиторы апоптоза пригодны для лечения ряда нейродегенеративных заболеваний, таких как рассеянный склероз, инсульт, травмы мозга, инфаркт миокарда [Marmur J.,1961]. Индукторы апоптоза необходимы прежде всего для лечения злокачественных новообразований, аутоиммунных расстройств [Исаева М.П. и соавт.,1998]. Особый интерес представляют исследования, касающиеся изучения процессов запрограммированной клеточной гибели при ИМ. Исследование морфологии и анализ ДНК Т-лимфоцитов позволили установить, что вирусный интерлейкин-10 (продукт репликации EBV) ингибирует потерю клетками объема, уплотнение хроматина и фрагментацию ДНК, характеризующие апоптоз [Taga H. e. a., 1994; T. Uehara e. a., 1992], напротив, при остром ИМ было зарегистрировано повышение Т-клеток с признаками апоптоза. Известно, что некоторые цитокины типа интерлейкинов 2, 5, 6 могут препятствовать апоптозу Т-лимфоцитов [Исаева М.П. и соавт.,1998]. Исходя из этого, авторы предположили, что апоптотическая гибель большинства Т-лимфоцитов была связана с их миграцией из участков, активно продуцирующих данные факторы, в результате антигенного воздействия, то есть апоптоз Т-клеток представляется авторами как механизм антигенуправляемой селекции лимфоцитов [Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В.,1996; Marmur J.,1961]. Увеличение числа апоптотических Т-лимфоцитов (APS) при ИМ также наблюдали Y. Matsuoka e. a. [1997]. Уровень APS повышался на ранней стадии ИМ и нормализовался с уменьшением числа атипичных лимфоцитов. Авторы предполагают, что апоптоз Т-клеток при ИМ способствует восстановлению части поврежденных вирусом В-лимфоцитов [Taga H. e. a. , 1994].

Wagner e. a. [1995] показано, что стимуляция апоптоза в EBV-преобразованных лимфоцитах осуществляется Т-лимфоцитами, экспрессирующими BLT-экстеразу. Защиту В-лимфоцитов от апоптотической гибели обеспечивают экспрессируемые ими мембранные белки -LMP1 и BHRF1, кодируемые EBV [Исаева М.П. и соавт.,1998]. Защита осуществляется через регуляцию bcl-2-экспрессии лимфоцитами. Bcl-2 proto-oncogen кодирует внутренние митохондриальные белки, блокирующие запрограммированную гибель клеток, в связи с чем регулирование LMP1 и BHRF1 экспрессии. bcl-2 определяет живое состояние и гибель клетки. LMP1 предотвращает апоптоз, индуцируемый анти-fas-антителами, а BHRF1- анти-Pa8-антителами и TNF- [Akbar A. N. e. a., 1993].

Исходя из вышеизложенного, можно предположить, что апоптоз при ИМ служит механизмом, регулирующим численное соотношение В- и Т-клеток в популяции лимфоцитов на разных стадиях инфекционного процесса.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Таким образом, ИМ- доброкачественное лимфопролиферативное заболевание, достоверным диагностическим критерием которого являются изменения в системе крови. Своеобразным маркером заболевания служат “атипичные мононуклеары”, представляющие собой трансформированные под действием вирусных антигенов лимфоидные клетки. Одним из механизмов ограничения лимфопролиферативности процесса при ИМ является апоптоз, который регулирует численное соотношение В- и Т-клеток в популяции лимфоцитов на разных стадиях инфекционного процесса.

Однако литературные данные, касающиеся апоптотических реакций клеток в норме и при патологическом состоянии, и при ИМ в частности, немногочисленны и фрагментарны, что и послужило причиной настоящего исследования.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материал и объект исследования

Нами были обследованы дети, в возрасте от 7 до 14 лет, больные ИМ (инфекцией, вызванной вирусом Эпштейна-Барр) средней степени тяжести, острым и гладким течением и ОИЗ с МПС (цитомегаловирусная инфекция, инфекция, вызванная вирусом герпеса, иерсиниоз, различные формы ангин-фоликулярная, лакунарная, некротическая) в период развернутой клинико-гематологической картины заболевания (1 группа больных), в период реконвалесценции (2 группа больных) и в катамнезе (3 группа больных). Диагноз заболевания устанавливали по характерной клинико-гематологической картине заболевания и лабораторным данным. Диагноз ИМ во всех случаях подтверждали выявлением в сыворотке больных ДНК вируса Эпштейна-Барр методом полимеразной цепной реакции (отдел молекулярной биологии ЦНИЛ СГМУ) и антител к антигену вируса Эпштейна-Барр (Ig A, M, G к вирусному капсидному антигену, Ig G к раннему антигену) с помощью непрямой иммунофлюоресценции (лаборатория онковирусологии НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН).

Все дети, больные ИМ находились на лечении в инфекционных отделениях в 3 горбольницы г.Томска и в больницы им. Г.Е.Сибирцева.

Контрольную группу составили условно здоровые дети аналогичного возраста. Материал исследования – периферическая кровь. Забор крови осуществляли из локтевой вены, утром, натощак.

Распределение обследованных детей в зависимости от методов и сроков исследования можно наблюдать в табл. 1.

2.2. Исследование апоптоза лимфоцитов

2.2.1. Индукция апоптоза лимфоцитов in vitro

В пробирку вносили 0,4 мл плазмы гепаринизированной крови( 25 Ед/мл) и 2 мл солевого раствора Дульбекко, не содержащего Ca^2 и Mg^2(‘Sigma’, США). Контролем служила суспензия, состоящая из 0,4 мл плазмы гепаринизированной крови(25 Ед/мл) и 2 мл солевого раствора Дульбекко с 10 % ЭТС. Пробы инкубировали при 37 С в течение 6 часов.

2.2.2. Выделение ДНК лимфоцитов

1. В чистые полипропиленовые пробирки типа “Eppendorf” объемом 1,5 мл вносили 3 мкл носителя и 450 мкл денатурирующего раствора. Добавляли 450 мкл исследуемой сыворотки или плазмы крови, используя наконечники с фильтрами. Тщательно перемешивали на вортексе в течение 10 секунд. Затем инкубировали при комнатной температуре 10 минут. После этого центрифугировали 15 секунд при 12 тыс. об/мин, добавляли 100 мкл хлороформа и перемешивали на вортексе 5 секунд. Далее вновь центрифугировали при 12 тыс. об/мин 10 минут. Переносили до 300 мкл верхней фазы в чистую полипропиленовую пробирку, содержащую 300 мкл изопропилового спирта, перемешивали на вортексе 5 секунд. Чтобы избежать контаминации, данную процедуру проводили используя наконечники с фильтрами. После этого центрифугировали при 12 тыс. об/мин 15 минут. Удаляли супернатант, используя водоструйный насос, в колбу-ловушку. К осадку добавляли 1 мл промывочного раствора, перемешивали и вновь центрифугировали при 12 тыс. об/мин 5 минут. Далее как можно тщательнее удаляли супернатант, осадок подсушивали 10-20 минут, добавляя 30 мкл деионизированной воды, закрывали пробирки, инкубировали 10 минут при комнатной температуре, перемешивали встряхиванием.

2.2.3. Исследование фрагментации ДНК лимфоцитов

Характеристики

Список файлов реферата