166647 (625071), страница 3

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 3)

Арабиногалактан. В растительных клеточных стеках обнаруживают арабиногалактан двух типов. В первом из них галактозные звенья соединены по С-4, во втором – по С-3 или С-6. Арабиногалактан II типа входит также в состав протеогликанов клеточной стенки. Антитела на арабиногалактан II типа реагируют и с арабиногалактановыми белками, и с рамногалактуронаном I, свидетельствуя, что в состав этих сложных молекул могут входить одинаковые арабиногалактановые звенья.

Прочно связанные полисахариды

Типы первичной клеточной стенки.

Типы вторичной клеточной стенки

Клеточная стенка ксиланового типа

Клеточная стенка желатинозного типа

Характеристика клеточных стенок исследуемых объектов

Клеточная стенка клеток ксилемы льна

Клеточная стенка волокон кокоса

Клеточная стенка волокон банана

Экспериментальная часть

2. Материалы и методы

2.1 Растительный материал

Лен (Linum usitatissimum) – лубоволокнистые культуры в которых формирование клеточных стенок проходит исключительно интенсивно, а стадии развития детально охарактеризованы (Горшкова и др., 2003;). Ксилема для анализа была взята ниже точки слома 5 см, растения собирали через месяц после посадки. Лен был выращен на открытом грунте. Ксилему от флоэмы отчищали вручную, старались максимально отчистить от флоэмы, поэтому этот процесс проводился дважды, а те участки, которые плохо поддавались отчистки просто отбрасывались.

Волокна банана.

Волокна кокоса.

2.2 Подготовка ксилемы льна к экспериментальной части

1) Фиксировали замороженную ксилему при 100⁰С тридцать минут.

2) Сушили 60 минут при 60⁰С.

3) Измельчали ксилему на «мельнице».

Отчистка от непрочносвязынных пектиновых и гемицеллюлозных веществ

1. 2 гр. ксилемы заливаем 100 гр. 1% оксалата аммония.

2. Эту колбу с смесью кипятим на водяной бане 60 минут при 97⁰С, при этом колба закрыта.

3. Охлаждаем колбу.

4. Эту смесь центрифугируем 10 мин на 4000 об/мин и сливаем надосадочную жидкость.

5. Еще раз заливаем 1% оксалатом аммония нашу смесь и кипятим на водяной бане 30 мин., также центрифугируем.

6. Вымываем оксалат аммония водой: заливаем дисцилированную воду в центрифужные стаканчики тщательно перемешиваем и центрифугируем на 4000 об/мин.

7. Так еще три раза. Проверяем рН универсальной лакмусовой бумажкой.

8. Готовим раствор 4Н КОН и 3% борной кислоты: 44,888 гр. КОН и 6 гр. Н₃ВО₃ на 200 мл. дисцилированной воды.

9. Заливаем 100 мл раствора к ксилеме и отстаиваем 1 час, затем центрифугируем и выливаем надосадочную жидкость.

10. Промываем водой: заливаем дисцилированную воду в центрифужные стаканчики тщательно перемешиваем и центрифугируем на 4000 об/мин. промываем до тех пор пока рН среды не будет нейтральным.

2.3 Растворение целлюлозы

Получение раствора хлорида лития в N, N – диметилацетамиде

1. N, N-диметилацетамид (ДМА) сушили над молекулярными ситами 4А.

2. В колбу присыпали 8 гр. хлорида лития и нагревали в термостате до 180⁰ в течение 4–5 часов, затем охлаждали и приливали 100 мл. высушенного над молекулярным ситом ДМА.

3. Колбу закрывали стеклянной пробкой и раствор перемешивали на шейкере до растворения хлорида лития (оставляли на ночь).

Выделение прочно связанных полисахаридов из растворенной целлюлозы клеточной стенки ксилемы льна

1. 1 гр. «целлюлозы» суспензировали в 10 мл. воды 40–60 мин.

2. Отделяли на воронке Шота со вставленным нейлоновым фильтром.

3. Осадок промывали на фильтре ацетоном.

4. Выдерживали в ацетоне (10 мл., 60 мин.)

5. Осадок промывали на фильтре ДМА

6. Выдерживали в ДМА (10 мл., 40–60 мин.)

7. Оставляли на ночь в свежей порции ДМА

8. На воронке шота отделяли «целлюлозу»

9. Суспензировали ее в 100 мл раствора хлорида лития в N, N – диметилацетамиде.

10) Колбу закрывали стеклянной пробкой и перемешивали до растворения целлюлозы на шейкере (1–2 дня).

11) Раствор целлюлозы по каплям добавляли к 100 мл. дисцилированной воды при перемешивание на магнитной мешалке. Раствор оставляли на ночь.

12) Отделяли выпавшую целлюлозу на воронке Шота с нейлоновым фильтром и промывали ее два – три раза дисцилированной водой (по 50 мл.) Получили Фильтрат 1

13) Фильтрат 1 Заливали в диалезный мешок 12 – 14 тысяч Дальтон.

14) Диалезный мешок клали в 3-х литровую банк с дисцилированной водой и ставили на магнитную мешалку, воду в банке меняли 4 раза.

15) На роторном испарителе концентрировали раствор.

16) Хроматографируем концентрированный раствор. Готовим 40 пробирок, моем их хромкой и сушим в сушильном шкафу при 120⁰С.

17) На хроматографе задаем программу (по каплям, 40 пробирок, в одну пробирку 40 капель ≈ 1,8 мл.)

18) В эпиндорф вливаем концентрированный раствор и центрифугируем 5 мин. при 6 000 об/мин.

19) Хроматографирование на Sepharose CL-4B элюент 0,02% NaN₃ и АсNa 10 mM pH 5,5, разделение по молекулярным массам.

20) Определяем количество сахаров методом Дюбуа (фенольным методом). 200 мкл образца+200 мкл 5% раствора фенола, помещаем пробирки в холодную воду и добавляем 1 мл. концентрированной серной кислоты. Кипятим на водяной бане 10 минут и охлаждаем. Измеряем оптическую плотность при 490 нм. (Смотри гафик1)

21) Выпавшую целлюлозу суспензировали в 50 мл 0,01 М растворе NaAc, рН 4,5 + 0,05% NaN₃, содержавший 0,1 мл раствора целлюлазы и инкубировали в течение ночи.

22) Раствор фильтровали на воронке Шота и осадок заново суспезировали в новой порции раствора фермента. Мы получили фильтрат 2.

23) Фильтрат 2 обессоливали на колонке Sephadex G-25, элюент 0,02% NaN₃. 0,005 гр. Blue Dextran 2000 кД и 0,250 гр. СоCl₂ растворяли в 5 мл дисцилированной воды и хроматографируем. Blue Dextran 2000 кД начало 25 мл конец 30 мл. СоCl₂ начало 60 мл. конец 73 мл.

24) Хроматографирование на Sepharose CL-4B элюент 0,02% NaN₃ и АсNa 10 mM pH 5,5, разделение по молекулярным массам.

25) Определяем количество сахаров методом Дюбуа (фенольным методом). 200 мкл образца+200 мкл 5% раствора фенола, помещаем пробирки в холодную воду и добавляем 1 мл. концентрированной серной кислоты. Кипятим на водяной бане 10 минут и охлаждаем. Измеряем оптическую плотность при 490 нм (Смотри график2).

2.4 Моносахаридный анализ

1. Фильтрат 1 и Фильтрат 2 обессоливаем на колонке Sepharose G250, элюент 10мМ пиридин и 10мМ уксусная кислота рН 4,5.

2. Высушиваем при 60⁰С до полного отсутствия воды.

3. Добавляем 400 мл ТФУ (Трифторуксусная кислота), помещаем в сушильный шкаф на 1 час при температуре 120⁰С.

4. Затем опять сушим при 60⁰С

5. Растворяем водой и определяем моносахаридный соcтав на Daionex (Данные моносахаридного состава смотри в таблице 1).

6. Мы объединили наши пробирки в следующие фракции до целлюлазной обработки: фракция 1 5–10; фракция 2 11–16; фракция 3 17–23; фракция 4 24–26; фракция 5 27–35.

Фракции после целлюлазной обработки: фракция 1 6–10; фракция 2 11–16; фракция 3 17–19; фракция 4 20–24; фракция 5 25–26; фракция 6 27–31.

Рисунок 1 – Распределение прочносвязанных полисахаридов во фракциях после растворения целлюлозы до ферментативной обработки.

Рисунок 2 – Распределение прочносвязанных полисахаридов после растворения после ферментативной обработки

Таблица 1. Моносахаридный состав во фракциях

	Рамноза	Арабиноза	Галактоза	Глюкоза	Ксилоза	Галактуроновая кислота	Глюкуроновая кислота
Фракция 1, после целлюлазы	49.290	33.680	68.173	7.624	5.855	254.246	1.166
Фракция 2, после целлюлазы	61.981	43.261	99.500	6.804	13.317	311.360	3.365
Фракция 3, после целлюлазы	25.478	17.145	79.425	6.605	31.317	161.033	10.089
Фракция 4, после целлюлазы	6.349	7.295	48.161	25.828	86.452	67.533	10.577
Фракция 5, после целлюлазы	4.020	14.716	40.078	40.401	210.336	3.171	5.546
Фракция 6, после целлюлазы	1.678	4.407	13.217	28.017	136.191	6.781	1.291
Фракция 1, до целлюлазы	0	0	0	0	0.535	358.507	0
Фракция 2, до целлюлазы	0.556	0.481	2.689	5.364	1.107	0.476	0
Фракция 3, до целлюлазы	12.596	15.664	39.576	12.444	0	21.317	1.393
Фракция 4, до целлюлазы	20.762	24.131	54.572	11.218	54.753	67.032	2.955
Фракция 5, до целлюлазы	82.195	151.536	325.976	131.493	0	426.007	19.982

3. Результаты и их обсуждение

При подготовке ксилемы в первую очередь надо было остановить все процессы происходящие в ней поэтому фиксировали ее. Обработка ксилемы включала два основных этапов. Первое – механическое растирание на мельнице для того что бы получит муку, так как так лучше будет удаляться не прочно связанные вещества с целлюлозой и лучше растворяться. Второе – экстракция пектина и гемицеллюлозы с хелатирующими и щёлочными растворами.

Удаление пектиновых веществ с мы осуществили с помощью оксалата аммония, как известно пектиновые вещества связаны между собой ионами Са, а оксалат аммония является хелатирующим веществом которое связывается с ионами Са и пектиновые вещества отделяются от целлюлозы. Для удаление оксалата аммония и пектиновых веществ из нашей колбы мы центрифугируем их 3 раза с водой.

Обработка клеточной стенки ксилемы льна 4% NaOH позволяла извлекать гемицеллюлозные вещества, которые не извлекаются оксалатом аммония, нужен более сильный раствор. Мы применяли 4% NaOH который высвобождает целлюлозу от гемицеллюлозных веществ. Затем мы снова удаляли щелочь и гемицеллюлозные вещества с помощью метода центрифугирования при этом проверяли рН универсальной лакмусовой бумажкой, промывали до нейтрального.

Выдерживание в воде «отчищенной» ксилемы необходимо для так называемой активации, без этого этапа целлюлоза не растворяется. Выдерживание в ацетоне и ДМА необходимо для полного удаления воды, так как при наличие воды целлюлоза выподает в осадок. Клеточную стенку волокна растворяли в 8% растворе LiCl в ДМА, и заново осаждали целлюлозу путём добавления воды. Осаждение в воде необходимо для того что бы фермент полностью расщепил целлюлозу, если опустить этот этап то целлюлоза плохо будет подвергаться гидролизу. 8% раствор LiCl в ДМА мы используем так как они вместе являются хорошими растворителями целлюлозы и не реагируют с ней, к тому от них легко избавиться с помощью хроматографии. Раствор отделяли от целлюлозы (Фильтрат 1). Целлюлозу суспензировали в содержащем целлюлазу ацетатном буфере. В течение 1–2 суток фермент растворял осаждённую целлюлозу (Фильтрат 2). Мы получили раствор прочно связанных полисахаридов с целлюлозой. Далее с помощью ТФУ мы разрушаем все гликозидные связи и при высушивание весь ТФУ испаряется, и остаются мономеры сахаров. Dionex эта ионно-обменная хроматография, на ней мы и определяем моносахаридный состав, заранее вкалываются стандарты моносахоров по которым мы и опознаем конкретный моносахар.

В дальнейшем планируется провести ЯМР анализ и определить тип связующих гликанов.

Выводы

1. Отчистили клеточную стенку от пектиновых и гемицеллюлозных веществ.

2. Получили раствор прочносвязанных с целлюлозой полисахаридов.

3. Разделили фракции по молекулярным массам.

4. Определили моносахаридный состав во фракциях.

Литература

1. Керне, А. Жизнь растений. / А. Керне // СПб.: Просвещение, – 1906. – Т. 2. – 838 с.

2. Полевой, В.В. Физиология растений. / В.В. Полевой // М.: Высшая школа, – 1989. – 464 с.

3. Brett, C.T. Cellulose microfibrils in plants: biosynthesis, deposition, and integration into the cell wall / C.T. Brett // Int. Rev. Cytol. – 2000. – V. 199. – P. 61–99.

4. Chivasa, S., Proteomic analysis of the Arabidopsis thaliana cell wall / S. Chivasa, B.K. Ndimba, W.J. Simon, D. Robertson, X.L. Yu, J.P. Knox, P. Bolwell, A.R. Slabas // Electrophoresis. – 2002. – V. 23. – P. 1754–1765.

5. Cosgrove, D.J. Group I allergens of grass pollen as cell wall-loosening agents / D.J. Cosgrove, P.A. Bedinger, D.M. Durachko // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1997. – V. 94. – P. 6559–6564.

6. Delmer, D. Cellulose biosynthesis: exciting times for a difficult field of study / D. Delmer // Plant Physiol. Plant Mol. Biol. – 1999. – V. 50. – P. 245–276.

7. DeWitt, G. Comparative compositional analysis of walls with two different morphologies: archetypical versus transfer-cell-like / G. DeWitt, J. Richards, D. Mohnen, A.M. Jones / Protoplasma. – 1999. – V. 209. – №3/4. – P. 238–245.

8. Frey-Wissling, A. Submicroscopic morphology of protoplasm and its derivatives. / A. Frey-Wissling. // N.Y.: Elsevier. – 1948. – 47 p.

9. Fry, S.C. The growing plant cell wall: chemical and metabolic analysis. / S.C. Fry // London: Longman Sci. and Technic. – 1988. – 333 p.

10. Fry, S.C., Xyloglucan endotransglucosylase, a new wall-loosening enzyme activity from plants / S.C. Fry, R.C. Smith, K.F. Renwick, D.J. Martin, S.K. Hodge, K.J. Matthews // Biochem. J. – 1992. – V. 282. – P. 821–828.

11. Gaspar, T., Peroxidases 1970–1980: A survey of their biochemical and physiologic roles in higher plants. / T. Gaspar, C. Penel, T. Thorpe, H. Greppin. // Switzerland: University of Geneva Press. – 1982. – P. 60–121.

12. Gaspar, Y., The complex structures of arabinogalactan-proteins and the journey towards understanding function / Y. Gaspar, K.L. Johnson, J.A. McKenna, A. Bacic, C.J. Schultz // Plant Mol. Biol. – 2001. – V. 47. – P. 161–176.

13. Jarvis, M.C. Control of thickness of collenchyma cell walls by pectins / M.C. Jarvis // Planta. – 1992. – V. 187. – P. 218–220.

14. Jose-Estaniol, M., Plant cell wall glycoproteins and their genes / M. Jose-Estaniol, P. Puigdomenech // Plant Physiol. Biochem. – 2000. – V. 38. – №1/2. – P. 97–108.

15. Lamport, D.T.A. The protein component of primary cell walls / D.T.A. Lamport // Adv. Bot. Res. – 1965. – V. 2. – P. 151–218.

16. Lamport, D.T.A., The use of tissue cultures for the study of plant cell walls / D.T.A. Lamport, D.H. Northcote // Biochem. J. – 1960. – V. 76. – P. 52.

17. Mohnen, D. Biosynthesis of pectins and galactomannans / D. Mohnen // Comprehensive Natural Products Chemistry / Eds Pinto B.M., Barton D.H.R., Meth-Cohn O. Oxford: Elsevier. – 1999. – P. 497–527.

18. Mohnen, D. Biosynthesis of pectins and galactomannans / D. Mohnen // Comprehensive Natural Products Chemistry / Eds Pinto B.M., Barton D.H.R., Meth-Cohn O. Oxford: Elsevier. – 1999. – P. 497–527.

19. Nishitani, K., Endo-xyloglucan transferase, a novel class of glycosyltransferase that catalyzes transfer of a segment of xyloglucan molecule to another xyloglucan molecule / K. Nishitani, R. Tominaga // J. of Biol. Chem. – 1992. – V. 267. – P. 21058–21064.

20. Saxena, I.M., Cellulose biosynthesis: current views and evolving concepts / I.M. Saxena, R.M. Brown // Ann. Bot. – 2005. – V. 96. – №1. – P. 9–21.

21. Schroder, R., Mannan transglycosylase: a novel enzyme activity in cell walls of higher plants / R. Schroder, T.F. Wegrzyn, K.M. Bolitho, R.J. Redgwell // Planta. – 2004. – V. 219. – P. 590–600.

22. Schroder, R., LeMAN4 endo-beta-mannanase from ripe tomato fruit can act as a mannan transglycosylase or hydrolase / R. Schroder, T.F. Wegrzyn, N.N. Sharma, R.G. Atkinson // Planta. – 2006. – V. 224. – P. 1091–1102.

Характеристики

Список файлов курсовой работы