Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 5)

Если для расчетов была выбрана программа VARSELEC, то необходимо также установить порядок исключения спектров из исходного базисного набора для процедуры "выбора переменных" с помощью команды главного меню Options/Var.select. Для этого необходимо указать число спектров, исключаемых на каждом шаге вычислений. После его задания автоматически вычисляется общее количество шагов, требуемых для перебора всех возможных комбинаций. Если перебор всех возможных комбинаций не требуется, необходимо указать номер начальной и конечной комбинации.

Время вычислений равняется в среднем 1-3 минутам, однако может составлять значительно больший интервал для программы VARSELEC при задании очень большого количества комбинаций базисных спектров.

Результаты вычислений можно просмотреть с помощью команды Calculate/Result.

2. Инфракрасные спектры поглощения белков

2.1 Поглощение белков в ИК-области

Поглощение света в видимом и ультрафиолетовом диапазонах обусловлено электронными переходами в молекулах поглощающего вещества. Поглощение света в инфракрасном диапазоне имеет иную природу. Оно связано с переходами между колебательными уровнями основного состояния молекулы. Полосы поглощения, отвечающие колебательным переходам, обычно лежат в диапазоне длин волн от 2000 до 50000 нм или, как принято записывать для ИК-спектров, в диапазоне волновых чисел от 5000 до 200 см^-1.

Колебательные спектры подчиняются в сущности тем же закономерностям, что и электронные. Однако для колебательных переходов характерна значительно меньшая интенсивность, чем для электронных. Следовательно, при регистрации ИК-спектра образец должен быть гораздо более концентрированным. Кроме этого, многие полосы ИК-спектров белков, в том числе соответствующие пептидным хромафорам, расположены в той спектральной области, где наблюдается сильное поглощение воды. Использование D₂О вместо Н₂О иногда помогает обойти эту трудность, но не решает проблему полностью, поскольку полная замена лабильных протонов белка на дейтерий часто связана с потерей его нативной конформации.

Описываемый ниже метод определения вторичной структуры белка основан на использовании ИК-спектров поглощения белков в Н₂О [8-10]. Проблема, связанная с их измерением, была решена авторами метода с помощью довольно сложной процедуры компенсации поглощения воды и использования очень узких ячеек (с длиной оптического пути около 6-12 мкм). Поскольку все измерения проводились в Н₂О трудностей с поддержанием нативной конформации белков не возникало.

Колебательные полосы поглощения обычно порождаются переходами, которые можно довольно точно отнести к определенным химическим связям. В случае белков наиболее интересными являются три инфракрасные полосы, соответствующие колебательным переходам в пептидном остове. Это полосы, связанные с растяжением связи N-H (около 3300 см^-1), растяжением связи C=O (1640-1660 см^-1, полоса амид I) и деформацией связи N-H (1520-1550 см^-1, полоса амид II). Эти полосы довольно легко зарегистрировать, поскольку каждое пептидное звено дает вклад в их интенсивность.

Образование водородных связей при формировании вторичной структуры белка приводит к сдвигу энергии этих трех пептидных колебаний. Первые две полосы, отвечающие валентным колебаниям, смещаются в область более низких энергий, поскольку наличие водородной связи облегчает смещение атома азота амидной группы и атома кислорода карбонильной группы в направлении акцептора или донора протона соответственно. Полоса амид II смещается в сторону более высоких энергий, так как водородная связь препятствует изгибанию связи N-H.

Влияние водородных связей на полосы амид I и амид II в случае -спирали и -структуры оказывается различным, что дает возможность использовать ИК-спектры для определения вторичной структуры белков. Ниже представлена таблица, суммирующая данные о влиянии вторичной структуры на положение полос амид I и амид II. В ней приведены положения максимумов (₀) и значения интенсивности в максимумах (Е₀) для полос амид I и амид II, усредненные по нескольким модельным полипептидам и фибриллярным белкам в Н₂О [9]:

Тип вторичной	Амид I			Амид II
структуры	0, см-1	Е0, лмоль-1см-1	0, см-1		Е0, лмоль-1см-1
-спираль	1647	700	1551 1520		310 80
-структура	1695 1619	180 980	1533 1563		340 100
неупорядочен- ная форма	1651	320	1550		210

Следует отметить, что расщепление полос амид I и амид II происходит за счет взаимосвязанности колебаний в отдельных пептидных группах.

На рисунке 2.1.1 представлены ИК-спектры трех модельных полипептидов, находящихся в конформациях -спирали, -структуры и неупорядоченной формы.

2.2 Методы анализа ИК-спектров белков

В целом, проблемы, решаемые при анализе ИК-спектров белков с целью определения их вторичной структуры, очень схожы с проблемами, возникающими при анализе спектров кругового дихроизма белков. При этом также используется набор ИК-спектров белков с известной вторичной структурой, используемых в качестве базисных. Так, например, в методе, описанном в работах [8-10], анализ базисного набора, состоящего из 13 спектров глобулярных белков и 6 спектров фибриллярных белков и полипептидов в Н₂О в диапазоне 1800-1480 см^-1, осуществляется с помощью методов "регуляризации" [4] и "ортогональных спектров" [6], рассмотренных выше.

Авторы этого метода вводят дополнительную процедуру, позволяющую исключить вклад в ИК-спектр белка поглощения боковых групп аминокислотных остатков. Ими было показано, что этот вклад составляет около 20% от суммарной интенсивности полос амид I и амид II. Возможность проведения такой процедуры определяется тем, что вклады в ИК-спектр поглощения белка от боковых групп аминокислотных остатков и полипептидного остова являются аддитивными. Для оценки поглощения боковых групп было проведено измерение ИК-спектров водных (Н₂О) растворов аминокислот. Оказалось, что наиболее сильно поглощают в исследуемой части ИК-диапазона боковые группы аминокислот аспарагина, глутамина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, аргинина, лизина, тирозина, фенилаланина и гистидина. Было обнаружено также сильное поглощение заряженных -амино - и -карбоксильной групп аминокислот. Поэтому их поглощение также необходимо учитывать при анализе белкового спектра. Суммарно, ИК-спектр белка может быть представлен в следующем виде:

. (2.2.1)

- спектр поглощения полипептидного остова белка, а - спектр поглощения боковых групп аминокислотных остатков белка, вычисляемый по формуле

, (2.2.2)

где - спектр поглощения k-ой аминокислоты, - число k-ых аминокислот в белке, а - общее число аминокислот в белке. N - и С-концевые - NH₂ и - COOH группы белка также должны быть включены в эту формулу наравне с аминокислотами. Пример исключения из ИК-спектра рибонуклеазы А вклада от поглощения боковых групп аминокислотных остатков приведен на рисунке 2.2.1 Таким образом, данный метод анализа ИК-спектров полностью аналогичен методам анализа спектров КД белков, за исключением того, что в нем используются не реальные белковые спектры, а вычисленные с помощью формул (2.2.1) и (2.2.2) спектры поглощения пептидного остова белков.

Авторы метода использовали для анализа шесть типов вторичной структуры белка: упорядоченная (H_o) и неупорядоченная (H_d) формы -спирали, упорядоченная (В_o) и неупорядоченная (В_d) формы -структуры, -изгиб (Т) и остальные формы (R). К неупорядоченной форме -спирали были отнесены по два аминокислотных остатка с каждой стороны спирального сегмента, а к неупорядоченной форме -структуры - аминокислотные остатки -нитей, образующие "неклассические" водородные связи.

Применение к выбранному базисному набору метода "ортогональных спектров" [6] привело к получению 11 ортогональных спектров, амплитуда которых превышает экспериментальную ошибку, возникающую при регистрации ИК-спектров. Пять "наиболее значимых" ортогональных спектров показано на рисунке 2.2.2.

Экспериментальная проверка точности анализа ИК-спектров белков на белках из базисного набора дала следующие коэффициенты корреляции (смотри раздел 1.2):

Метод	Ho	Hd	Bo	Bd	T	R
"регуляризации"	0.97	0.77	0.94	0.91	0.80	0.48
"ортогональных спектров"	0.98	0.80	0.93	0.90	0.75	0.48
"регуляризации" (без исключения поглощения боковых групп аминокислот)	0.92	0.68	0.85	0.90	0.53	0.32

2.3 Работа с пакетом программ STRUC по анализу ИК-спектров белков

Пакет программ STRUC разработан в институте белка РАН [10]. Он предназначен для анализа инфракрасных спектров поглощения белков и определения их вторичной структуры. Алгоритм анализа спектров основан на оригинальном методе авторов программы [8-10] (смотри выше). Пакет STRUC состоит из следующих программ и вспомогательных файлов:

• STRUC.BAT - командный файл, используемый для определения вторичной структуры белка. Он организует работу следующих трех программ:

• AMACIR (файл amacir.exe) - программа, исключающая из ИК-спектра поглощения белка вклад от поглощения боковых групп аминокислотных остатков по методу [8];

• SVDIR (файл svdir.exe) - программа, определяющая вторичную структуру белка методом "ортогональных спектров" [6];

• CONTIR (файл contir.exe) - программа, определяющая вторичную структуру белка методом "регуляризации" [4].

• VISUAL.BAT - командный файл, предназначенный для графического воспроизведения ИК-спектра поглощения белка. Он организует работу следующих двух программ:

• PLOTFL (файл plotfl.exe) - программа, осуществляющая преобразование спектров поглощения к формату, используемому программой PLOTNIK;

• PLOTNIK (файл plotnik.exe) - программа, осуществляющая графическое построение ИК-спектра поглощения белка.

• SOURCE - файл, содержащий входные данные для программы AMACIR (в том числе сам ИК-спектр поглощения белка).

• OUT.SVD и OUT.CON - файлы, являющиеся результатом работы программ SVDIR и CONTIR, содержащие данные по оценке вторичной структуры белка соответствующими методами.

Программы, входящие в пакет STRUC, не имеют системы экранного интерфейса, и работа с ними осуществляется из командной строки. Перед началом работы с пакетом необходимо создать текстовый файл SOURCE (рекомендуется скопировать уже имеющийся) и записать в него исходные данные по исследуемому белку и его ИК-спектру поглощения, необходимые для работы программ. Формат этого файла следующий:

Номер строки	Содержание
1	Идентификатор файла (длиной не более 70 символов)
2, 3	Формат записи числовых значений спектра в строках 6 - 14. По умолчанию устанавливается формат (10F6.0) - по 10 значений в каждой строке в форме действительного числа с фиксированной десятичной точкой, причем на запись всего числа отводится 6 позиций, из которых 0 позиций - на десятичную часть. (Для действительных чисел с плавающей десятичной точкой вместо символа 'F' следует записать символ 'E'.)
5	Спектральный диапазон (по волновым числам), используемый для вычислений, и число точек в спектре. Максимально допустимый спектральный диапазон составляет 1800 - 1480 см-1 при числе точек в спектре, равном 81. При задании диапазона и числа точек необходимо сохранять интервал между точками равным 4 см-1.
6 - 14	ИК-спектр поглощения белка, выраженный в единицах л моль-1см-1.
17	Содержит единственный символ '*', положение которого определяет тип записи данных по аминокислотному составу белка: (а) NAmAc - указывается абсолютное количество остатков каждой аминокислоты в белке; (б) NAmAc/N - указывается абсолютное количество остатков каждой аминокислоты в белке, деленное на общее количество аминокислотных остатков.
19 - 40	Аминокислотный состав белка. Здесь же отдельно указываются N - и C-концевые группы белка.
42	Общее количество аминокислотных остатков в белке и значение pH, при котором снимался спектр. Указывать значение pH нужно обязательно, а общее количество аминокислотных остатков - только в том случае, если при записи аминокислотного состава белка записывались относительные доли аминокислотных остатков (вариант (б)).
43	Комментарий к файлу

Пример заполнения файла можно посмотреть в уже имеющемся файле SOURCE.

Характеристики

Список файлов книги