14099 (596894), страница 2
Текст из файла (страница 2)
8. Определение среднего содержания гемоглобина в одном эритроците (СГЭ)
Показатель среднего содержания гемоглобина в одном эритроците очень важен для выявления гипо- и гиперхромачии. СГЭ в одном эритроците принято выражать в пикограммах (синоним - микромикрограмм); 1 пг- КГ12 г.
8.1. Ход определения и учет результатов.
СГЭ в одном эритроците определяют делением концентрации гемоглобина в 1 мкл крови, выраженной в грамм-процентах, на число эритроцитов в этом же объеме. Для упрощения расчетов можно разделить содержание гемоглобина, выраженное в г/л, на число эритроцитов в миллионах.
9. Определение среднего объема эритроцитов
Для выяснения наличия микро- и макроцитозов наряду с непосредственным измерением размеров эритроцитов на мазках удобнее вычислять средний объем эритроцитов косвенно, который выражают в кубических микрометрах (мкм3).
9.1. Ход определения и учет результатов.
Для определения среднего объема эритроцитов показания гематокритного числа делят на число эритроцитов в 1 мкл крови.
Практически средний объем эритроцитов определяют по формуле:
А х 1000/Б,
где: А - гематокритное число, л/л ; Б - число эритроцитов , млн /мкл .
10. Определение скорости оседания эритроцитов
В зависимости от физических и химических свойств крови эритроциты оседают в микрокапиллярах с различной скоростью. Скорость оседания эритроцитов определяется в аппаратах Панченкова и выражается в миллиметрах за 1 ч (мм/ч).
10.1. Оборудование и реактивы:
- часовое стекло,- аппарат Панченкова, состоящий из штатива и специальных капиллярных пипеток, на которых нанесена миллиметровая шкала длиной К) см; верхнее деление шкалы отмечено буквами О и К (кровь), против деления 50 имеется буква Р (реактив),
- профильтрованный 5-% раствор трехзамещенного лимоннокислого натрия.
10.2. Ход определения и учет результатов.
Промывают капиллярную пипетку раствором лимоннокислого натрия, затем набирают этот раствор до метки Р и выливают его в часовое стекло. Тем же капилляром набирают кровь 2 раза до метки К и спускают в часовое стекло. Хорошо перемешивают и, набрав смесь в капилляр до метки К, ставят в штатив на ! ч. По истечении этого времени определяют скорость оседания эритроцитов. Величину столбика плазмы, освободившегося от эритроцитов, учитывают по делениям на капиллярной пипетке.
При работе с молодью рыб допускается набирать меньший объем крови (1/2 или 1/4 К), при этом соотношение лимоннокислого натрия и крови необходимо строго сохранять на уровне 1:2.
11. Оценка эритроцитарной картины крови рыб
По соотношению молодых и зрелых форм эритроцитов оценивают активность эритропоэза. Соотношение эритроцитов выражают в процентах (%).
11.1. Оборудование:
- микроскоп,
- окрашенные мачки крови (см. п. 3.),
- иммерсионное масло.
11.2. Ход определения и учет результатов. Под микроскопом на мазке крови просматривают нс менее 1000 эритроцитов при увеличении х 630 (под иммерсией). Клетки идентифицируют, используя "Атлас клеток крови рыб" (Иванова, 1983) и выводят процент различных стадий созревания эритроцитов по формуле:
Х =• (А х 100)/1000= А х-0,1%,
где: А - число незрелых эритроцитов, встречающихся при подсчете 1000 эритроцитов;
Х - искомый процент незрелых эритроцитов.
12. Определение общего числа лейкоцитов
Лейкоциты, как клетки белой крови рыб, выполняют разнообразные физиологические и иммунологические функции. Они участвуют в регенерации поврежденных тканей, разрушении чужеродных тел, синтезе белка и антител, инкапсуляции паразитов и т.д. Существует непрямой (косвенный) и прямой способ учета лейкоцитов в периферической крови рыб. Число лейкоцитов выражают в 1 мкл крови (тыс. шт. / мкл).
12.1. Косвенный метод
12.1.1.Оборудование:
- микроскоп,
- окрашенные мазки крови (см. п. 3),
- иммерсионное масло.
12.1.2. Ход определения и учет результатов. Определяют число лейкоцитов, встречающихся при подсчете 1000 эритроцитов в мазке крови, и затем пересчитывают их количество на 1 мкл по формуле:
Х = (А х В)/1000,
где: Х - общее количество лейкоцитов в 1 мкл крови;
А - число эритроцитов в 1 мкл крови, определенное в камере Го-ряева:
В - число лейкоцитов, определенное при подсчете 1000 эритроцитов на мачке крови.
12.2. Прямой метод подсчета количества лейкоцитов 12.2.1
12.2.1. Подготовка к исследованию.
Приготовления растворов А и В
- 25 мг нейтральрота и 0,6 г натрия хлористого растворяют в 100 мл дистиллированной воды ( раствор А можно использовать одни сутки);
- 12 мг кристаллвиолета, 3,8 мг натрия цитрата и 0,4 мл формалина растворяют в 100 мл дистиллированной воды (раствор В использовать около недели).
12.2.2. Оборудование и реактивы:
- микроскоп,
- счетная камера форменных элементов крови,
- смеситель для подсчета эритроцитов млекопитающих,
- пастеровские пипетки - стерильные,
- часовое стекло,
-2 -% раствор натрия цитрата,
- растворы А и В.
12.2.3. Ход определения и учет результатов.
Взятие крови производят в соответствии с п.2 настоящих Методических указаний. Кровь из часового стекла набирают в смеситель для подсчета эритроцитов млекопитающих до метки 0,5 или 1. Кончик смесителя вытирают ватой, набирают в смеситель раствор А до половины расширения смесителя, затем до метки 101 заполняют раствором Б.
Если кровь набирают до метки 0,5, то получается разбавление в 200 раз, если до метки 1 - в 100 раз.
После наполнения со смесителя снимают резиновую трубку, зажимают его между большим и средним пальцем и перемешивают кровь с разбавляющей жидкостью. Смеситель оставляют в горизонтальном положении на 5-10 минут, затем вновь перемешивают. Первые 2-3 капли, выходящие из смесителя, стряхивают и только следующей каплей заряжают счетную камеру. Покровное стекло должно быть заранее притерто к счетной камере до появления колец Ньютона. Под действием растворов А и В происходит витальная окраска форменных элементов крови. Ядра лейкоцитов окрашиваются в темный фиолетово-красный цвет, а протоплазма - в розовый. В эритроцитах слабо окрашиваются только ядра. Благодаря этому эритроциты и лейкоциты различимы в камере.
Количество лейкоцитов подсчитывают в 80 больших квадратах и определяют их количество по формуле:
x=mx250xУ/п, гдe:
Х - число лейкоцитов в 1 мкл,
М- общее количество клеток в подсчитанных квадратах,
У - степень разбавления крови,
п - число просмотренных квадратов.
13. Выведение лейкоцитарной формулы.
Для характеристики лейкоцитозов и лейкопений, возникающих у рыб при различных заболеваниях, используют дифференциальный подсчет лейкоцитов, то есть выводят лейкоцитарную формулу. Количество различных групп лейкоцитов выражают в процентах (%).
Лейкоцитарный состав представлен у рыб эозинофилами, нейтрофи-лами, базофилами, относящимися к гранулоцитам; лимфоцитами и моноцитами, относящимися к агранулоцитам, а также бластами.
13.1. Оборудование:
- микроскоп,
- окрашенные мазки крови (см. п. 3.),
- иммерсионное масло.
13.2. Ход определения и учет результатов.
Для определения лейкоцитарной формулы производят подсчет 200 клеток белой крови в мазке под увеличением микроскопа об.90 х ок.7 (с иммерсией). Подсчет лейкоцитов лучше проводить в центральных и несколько удаленных от бокового края участках начальной трети части мазка. Все встречающиеся клетки белой крови записывают в специальную таблицу в соответствии с классификацией клеточных форм (Иванова, 1983) и рассчитывают процентное соотношение клеток белой крови, то есть групп лейкоцитов в процентах. Для этого используют формулу:
Х = (А х 100) / 200, где:
Х - процент определяемой группы клеток в лейкоцитарной формуле; А - количество этих клеток, найденное при подсчете 200 лейкоцитов (по показанию счетчика).
Лейкоцитарная формула указывает только на относительное соотношение лейкоцитов. Для определения их абсолютного значения используют формулу пересчета, т.е. выясняют количество каждого вида клеток в 1 мкл крови (шт./мкл).
Формула пересчета:
Х = (А х В) /100, где:
А - процент определяемой группы лейкоцитов в лейкоцитарной формуле, %;
В - общее число лейкоцитов в 1 мкл, тыс. шт./мкл;
100 - общий процент всех лейкоцитов в лейкоцитарной формуле. %.
14. Определение метгемоглобина
При накоплении метгемоглобина в крови выше определенного уровня возникает патологическое состояние, называемое метгемоглобинемией. Вследствие метгемоглобинемии снижается кислородная емкость крови и развивается гипоксия, что сопровождается торможением обменных процессов и накоплением недоокисленных продуктов в тканях.
Метод основан на сравнительном измерении оптической плотности растворов исследуемой крови с исходной концентрацией оксигемоглоби-на (гемоглобина) и параллельной пробы крови, в которой весь оксиге-моглобин окислен до метгемоглобина феррицианидом калия , с использованием фотоэлектроколориметра при красном светофильтре.
14.1. Подготовка к исследованию 0,25% - ный раствор аммиака готовят, добавляя к 1 мл аммиака 99 мл дистиллированной воды.
Насыщенный раствор фсррицианида калия готовят, растворяя 70 г этой соли в 100 мл дистиллированной воды, раствор хранят не более недели. Раствор гепарина готовят путем прибавления к 5 мл гепарина 20 мл дистиллированной воды.
14.2. Оборудование и реактивы
Аммиак водный (nh4ОН),ГОСТ 3760-64.
Калий железосинеродистый (феррицианнд калия, соль кровяная красная) ГОСТ 4206-65. Гепарин (25000 ед.).
Химические пробирки.
Пипетки на 1, 10 мл.
Фотоэлектроколориметр (ФЭК) с красным светофильтром.
14.3. Ход определения и учет результатов
Для а налита у исследуемых рыб отбирают в пробирку 1 мл крови из сердца или хвостовой артерии. Кровь стабилизируют, добавляя в пробирку 2-3 капли раствора гепарина. У молоди рыб возможно групповое взятие крови (от 2 рыб и более).
При необходимости перевозки или хранения проб крови, закрытые пробками пробирки с кровью помещают в термос со льдом или в морозильную камеру холодильника с температурой - 12° С, кровь можно хранить в течение нескольких суток.
Перед исследованием кровь размораживают и тщательно перемешивают.
В две химические пробирки наливают по 7,3 мл 0,25 %-го раствора аммиака и добавляют по 0,2 мл исследуемой пробы (из одной пробы крови). В одну из пробирок (пробирка № 2) добавляют 1-2 капли насыщенного раствора феррицианида калия, перемешивают содержимое пробирок и оставляют обе пробирки на 1 час. Через 1 час определяют величину оптической плотности (экстинцию) обоих растворов крови, в кюветах 10 мм при красном светофильтре, используя для сравнения 0,25 % -ный раствор аммиака.
В первой пробирке (пробирка № 1) определяют величину светопо-глощения раствора крови, с исходной концентрацией оксигемоглобина (гемоглобина), во второй пробирке (пробирка № 2) - величину светопо-глощения раствора крови, в которой весь оксигемоглобин (Нв02) превращен в метгемоглобин (mthb).
Содержание оксигемоглобина в исходной пробе крови соответствует содержанию гемоглобина в ней.
Поскольку в параллельной пробе крови (пробирка № 2) весь гемоглобин полностью переводится в метгемоглобин добавлением насыщенного раствора феррицианида калия, величина светопоглощеиил раствора метгемоглобина практически постоянная и зависит от исходного уровня гемоглобина, то есть оксигемоглобина.
Определение светопоглощенил растворов крови в обеих пробирках проводят на фотоэлекгроколориметре (ФЭКе) при красном светофильтре.
У ФЭКов различных марок длина волны, соответствующая максимуму пропускания при красном светофильтре, бывает различной. Так, у ФЭКа - 56 при работе с красным светофильтром № 8 длина волны составляет 597 нм, у спектрофотометров ФЭК-56 ПМ и ФЭК КФК-2 длины волн при работе с красным светофильтром лежат в интервале 600 -670 нм,
Определение светопоглощения растворов крови проводят с использованием ФЭКов различных марок при красном светофильтре в вышеприведенном интервале длины волн, используя для сравнения 0,25 %-ный раствор аммиака в кюветах с рабочей длиной 10 мм.
Различия, связанные с измерением экстинций растворов крови при различающихся длинах волн при работе на ФЭКах различных марок, корригируют путем введения в расчетную формулу коэффициента - величины приведенной экстинции раствора крови с исходным уровнем ок-сигемоглобина (ЕнвО2), как показано в разделе - расчет результатов анализа. При расчете этой приведенной величины используют измеренные опытным путем величины светопоглощения раствора крови с исходным уровнем оксигемоглобина (ЕнвО2)
- пробирка № 1; метгемоглобина (emthb) - пробирка № 2.
Предварительно опытным путем на молоди карповых рыб установлена средняя величина светопоглощения раствора крови с исходным уровнем оксигемоглобина (ЕнвО2) и средняя величина светопоглощения раствора крови с полученным уровнем метгемогдобина (ЕМthв).
Таким образом, найдено, что среднее значение плотности раствора крови с исходным уровнем оксигемоглобина (ЕнвО2) составляет 0,15, а метгемоглобина (emthb) - 0,77.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
