Диссертация (1335888), страница 16
Текст из файла (страница 16)
Рестриктазы Bse3DI и Bme18I применялисьдля определения аллельных вариантов «дикого типа» (359Ile / CYP2C9 и 144Arg /CYP2C9, соответственно). Рестриктаза MspI применялась для распознаваниясоответствующего генотипа гена VKORC1 (-1639(3673)G / VKORC1).Таблица 14Названия рестриктаз и размеры продуктов, получающиеся в результатерестрикцииЗамена / ГенРестриктазаРазмеры продуктоврестрикцииArg144Cys / CYP2C9Bme18I418 п.н. (192+226)Ile359Leu / CYP2C9Bse3DI102 п.н.
(80+22)MspI406 п.н. (230+76)G-1639(3673)A / VKORC1Расчет количества рестриктазы, необходимой для выполнения рестрикции,выполнялся по формуле:=где R — число единиц рестриктазы, ×ФФ ×,80Lλ — длина ДНК фага λ, составляющее приблизительно 48500 п.н.,mФ — масса продукта амплификации, предназначенного для рестрикции в мкг,LФ — длина амплифицируемого фрагмента в п.н.,nλ — количество сайтов рестрикции для данной рестриктазы на ДНК фага λ.Данная формула расчет может применяться для фрагментов, на которых имеетсятолько один сайт рестрикции для данной рестриктазы. В случае если фрагментсодержит несколько сайтов рестрикции, в формулу следует внести множитель,соответствующий числу сайтов.2.7.5 Электрофоретическое разделение ДНКПосле выполнения амплификации или рестрикции фрагменты ДНК былинанесены на полиакриламидный гель.
Для продуктов амплификации использовался5% гель, для рестрикционных фрагментов использовался 10% гель. По окончанииэлектрофореза гели окрашивали раствором бромистого этидия (0,5 мкг/мл) в течение10 мин. и визуализировали на трансиллюминаторе TCХ-15 M производства «VilberLourmat», Франция, закуплен в ООО «Диа-М», Россия, в ультрафиолетовом свете придлине волны 312 нм.Электрофорез проводили в вертикальной камере VE-4 (производство ЗАО «НПФДНК-Технология», РФ, закуплено там же) с использованием буфера ТВЕ последующей схеме: к пробам в объёме 4,5 мкл (в случае продуктов амплификации) или10 мкл (в случае продуктов рестрикции) добавляли 1/5 объёма буфера для внесенияпроб в гель.
Полученную смесь наслаивали в лунки геля при помощи специальногонаконечника с вытянутым кончиком. Размер фрагментов определяли с помощьюмаркёров молекулярного веса, наносимых в количестве 150 нг на дорожку.2.8 Методика определения полиморфизма гена SLCO1B1Определение полиморфизма гена проводилосьв лаборатории отделаперсонализированной медицины и клинической фармакогенетики ГКБ №23 им. М.В.Давыдовского.
Пациентам, включенным в исследование, проводилось определениегенетического полиморфизма гена SLCO1B1, ассоциированного с риском развитияпоражения мышечной ткани при приеме статинов. Определение полиморфизма гена81SLCO1B1 выполнялось путем выполнения ПЦР препаратов ДНК человека,полученных из периферической крови. Образцы крови, взятые у пациентов,доставлялись в лабораторию в течение 24 часов. На первом этапе проводилосьвыделение геномной ДНК из венозной крови с помощью реагента «ДНК-ЭКСПРЕССКРОВЬ» производства НПФ «ЛИТЕХ».
Выделение ДНК выполнялось согласно всоответствии с инструкцией к набору и включало следующие этапы: в пробирку типа «Эппендорф» добавляли 1000 мкл однородно перемешаннойвенозной крови; втечение5минут,прикомнатнойтемпературевыполнялосьцентрифугирование пробирки со скоростью 3000 оборотов в минуту прикомнатной температуре в течение 5 мин. После центрифугированияпроводилось отделение плазмы пипеткой; проводилось замораживание закрытой пробирки при температуре -20ºС втечение 1 часа до полного замораживания форменных элементов крови; проводилиразмораживаниесодержимогопробиркиприкомнатнойтемпературе; впробиркувносилиреактив«ДНК-экспресс-кровь»,равныйобъемусодержимого пробирки после чего в течение 10 секунд содержимое пробиркиперемешивали на вортексе; проводили осаждение капель на микроцентрифуге; пробирку выдерживали в предварительно прогретом до 98ºC термостате втечение 15 минут, после чего проводилось центрифугирование пробирки соскоростью 8000-14000 об/мин.
при комнатной температуре в течение 1 минуты;Полученный супернатант исследовали на приборе iQ 5 фирмы BioRad cприменением методики ПЦР Real time с использованием набора реагентов дляопределения полиморфизма SLCO1B1.Анализ образцов включал следующие этапы: проводилось размораживание образцов;82 смешивание компонентов набора и выделенной ДНК, с их дальнейшимцентрифугированием; приготовление двух реакционных смесей компонентов: Реакционная смесьаллель 1 и реакционная смесь аллель 2.
В дальнейшем проводилось добавлениекомпонентов в растовор из расчета на 1 пробу: 17,5 мкл разбавителя, 2,5 мклреакционной смеси, 0,2 мкл красителя SYBR Green, 0,2 мкл Таq – полимеразы; маркировка пробирок; в пробирки для ПЦР вносили по 20 мкл. смеси компонентов, после чего вносилипо 5 мкл. образца обработанной анализируемой пробы в пробирку с рабочейамплификационнойсмесьюаллель1ивпробиркусрабочейамплификационной смесью аллель 2; в качестве отрицательного контрольного образца в оба типа реакционной смесивносили разбавитель в объеме 5 мкл. Положительный контрольный образецвносили в объеме 5 мкл. в оба типа реакционной смеси; выполняли кратковременное центрифугирование образцов при 1500-3000оборотов в минуту при комнатной температуре, после чего пробирки собразцами помещалась в амплификатор; выполнялось две реакции амплификации – с двумя парами аллельспецифичных праймеров;Детекция продуктов амплификации осуществлялась прибором в автоматическомрежиме в каждом цикле амплификации.Результаты анализа позволяли дать три типа заключений: выявление гомозигот по аллели 1; выявление гетерозигот; выявление гомозигот по аллели 2.2.9 Оценка доступности фармакогенетического тестирования и частоты егоприменения врачами в рутинной клинической практикиВсего в ходе выполнения данной работы проведено анкетирование 137 врачей,работающих в медицинских учреждениях города Москвы с целью изучения83осведомленностипрактическихфармакогенетическоговрачейтестирования,овозможностипоказанияхвыполнениякпроведениюфармакогенетического тестирования, а также частоты применения данных методовисследования в реальной клинической практике в лечебно-профилактическихучреждениях города Москвы.
Так как наиболее частоты пациенты, с нозологиями,требующими проведения терапии непрямыми антикоагулянтами и статинамиобращаются к врачам-терапевтам и врачам-кардиологам они и стали основной«фокус»-группойдляпроведенияанкетирования.Всегованкетированииучувствовали 81 врач терапевт и 56 врачей-кардиологов. При проведениианкетирования учитывались и включены в дальнейший анализ такие параметры каквозрастврача,общийврачебныйстаж,местоработы(стационарилиполиклиническое отделение).2.10 Статистическая обработка результатовПолученныевходеисследованияданныеобработаныспомощьюстатистического пакета программ SPSS 21.0 for Windows с применением методовпараметрическойинепараметрическойстатистики.Вработепроводилсяописательный анализ всех пациентов, включенных в исследование.
Качественныепеременные описывались абсолютными и относительными (%) частотами, дляколичественныхпеременныхопределялисьсредниезначения,стандартноеотклонение, стандартная ошибка среднего значения. При сравнении двух групп снормальным характером распределения данных использовали t-тест для независимыхгруппировок, а при характере распределения, отличном от нормального, применяликритерий χ2.
Оценку достоверности различий по частотам аллелей междуисследуемыми группами проводили по критерию Н Краскала-Уоиллиса и ANOVA.Для сравнения фактических и ожидаемых частот в группах применяли критерийточной вероятности Фишера. Корреляционный анализ осуществлялся с помощьюкоэффициента корреляции Пирсона или коэффициента ранговой корреляцииСпирмена. Для всех видов анализа статистически значимыми различиямипризнавались при p <0,05.84ГЛАВА 3. ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ И ЦЕЛЕСООБРАЗНОСТИПРИМЕНЕНИЯ ФАРМАКОГЕНЕТИЧЕСОГО ТЕТСТИРОВАНИЯ ПРИНАЗНАЧЕНИИ ВАРФАРИНА.3.1 Изучение частоты выявления полиморфных вариантов CYP2C9Эффективность применения лекарственных препаратов и выраженностьтерапевтического эффекта, а также частота развития побочных эффектов на фонепроводимой фармакотерапии у пациентов представителей различных этническихможет значительно варьировать.
Генетически обусловленное изменение активностиизоферментов цитохрома р450, в частности CYP2C9 связано с замедленнымметаболизмом непрямых антикоагулянтов, что и определяет вариабельность доз уразличных пациентов [149]. Результаты исследований по показали выраженнуюмежэтническую вариабельность в популяциях по всему миру [172; 199]. Наиболееклинически значимыми маркерами полиморфизма изофермента CYP2C9 являютсяаминокислотные замены: Arg144Cys, которая приводит к замещению в 144положении полипептидной цепи изолейцина на лейцин. В следствие даннойаминокислотнойзаменыпоявляютсяполиморфныеизоформыCYP2C9*2(Arg144Cys) и CYP2C9*3 (Ile359Leu).
Также на эффективность и безопасность припроведенииварфаринотерапиизначительноевлияниеоказываетразличныхгенотипов гена VKORC1, так установлено, что у пациентов, носителей генотипа ААпо полиморфному маркёру G1639A при назначении варфарина по традиционнойсхеме статистически значимо более часто отмечаются кровотечения, а такжеповышение значений МНО выше терапевтического диапазона [284].В связи с этим изучение распространенности полиморфизма CYP2C9 иVKORC1. у пациентов московской популяции представляет большой интерес снаучной и практической точки зрения. В исследование и дальнейший анализвключено 2 группы пациентов:1.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
