Диссертация (1154858), страница 8
Текст из файла (страница 8)
На первом этапе проводят оценку цитотаксических эффектов,способность клеток адгезировать и заселять скаффолд в условиях in vitro. Вместес тем клеточные культуры не позволяют оценить иммунную реакцию целогоорганизма (Algul D. еt al., 2008; Erisken C. еt al., 2008). Именно поэтому приоценке биосовместимости методы, проводимые in vitro, обязательно дополняютсяимплантационными тестами с морфологическим исследованием биоптатовтканей, полученных из области размещения скаффолдов у экспериментальныхживотных. Проведение имплантационных тестов позволяет оценить местнуювоспалительную реакцию со стороны окружающих тканей как основногопараметра биосовместимости (Erisken C.
еt al., 2008).39Следуетотметить,чтосегоднявдоступнойлитературеимеетсяотносительно небольшое количество работ, посвященных взаимосвязи реакциймикроциркуляторного русла, воспалительных изменений и процессов заселенияскаффолдов клетками, а также васкуляризации. В частности, М Rücker в своихисследованиях указывает на решающее значение для тканевой инженерии в целоми для изготовлении трехмерных матриц в частности таких параметров, какбиологическая совместимость и способность к васкуляризации, считая умереннуювоспалительнуюреакциюпрямымстимуляторомангиогенезавимплантированном скаффолде (Rücker М.
еt al., 2006; Rücker М. еt al., 2008).Данная концепция была подтверждена экспериментально. Так, в одной из работприизучениискаффолданаосновеL-лактида-гликолидаспомощьюиммуноферментного анализа продемонстрировано, что в группе животных симплантацией матрицы через 14 дней VEGF был умеренно выше, чем вконтрольной группе. С помощью флуоресцентной микроскопии установлено, чтоповышениеVEGFсопровождалосьнебольшимувеличениемколичествалейкоцитов в зоне имплантации, повышением проницаемости микрососудов всвязи с умеренной воспалительной реакцией (Rücker М. еt al., 2006).В настоящее время концепция биосовместимости не подразумевает полнойинертности скаффолдов (Santos S.G. et al., 2013; Patik J.C. еt al., 2016). Былоустановлено,чтоотсутствиевоспалительногоответаприимплантациискаффолдов из полиуретана сопровождается слабовыраженной васкуляризацией(Laschke et al., 2009).
Напротив, введение иммуномодулирующих компонентов нафоне умеренной стимуляции воспаления обеспечивает активацию процессовзаселения скаффолдов клетками и ангиогенеза (Santos S.G. et al., 2013).Подводя итоги анализа современных литературных данных, следуетотметить, что технологии тканевой инженерии открывают значительныеперспективы для их применения в практической медицине. Использование длясоздания скаффолдов синтетических материалов, и в частности ПКЛ, обусловленоцелым рядом их преимуществ по сравнению с природными полимерами.Проблемы биосовместимости скаффолдов представляют наибольший интерес, в40то же время взаимосвязи реакций микроциркуляторного русла зоны имплантациис процессами заселения матриц клетками остаются недостаточно изученными.Вместе с тем для полной доклинической апробации отечественных скаффолдов наоснове ПКЛ с ГА необходимо проведение имплантационных тестов, чтоопределило цель и задачи настоящего исследования.41Глава 2МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ2.1.
Объекты исследования2.1.1. Объекты экспериментального исследования – скаффолдыВ работе проведена оценка биосовместимости отечественных скаффолдовна основе ПКЛ и ГА. Скаффолды были изготовлены лабораторией «Материалыспециальногоназначения»ФГБОУВО«Саратовскийнациональныйисследовательский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского»Минобрнауки России. Для изготовления скаффолдов использовался 9%-ныйраствор поликапролактона (формула (C6H10O2)n, молекулярная масса – 70–90 кДа) («Sigma-Aldrich» 3050 Spruce Street, Saint Louis, MO 63103, USA) в смесидихлорметана (ДХМ) и N-N-диметилформамида (ДМФА) и ГА (формула(Ca10(PO4)6(OH)2) производства «Norian Corporation» 1230 Wilson Drive, WestChester, PA 19380, U.S.A).Использованные в работе скаффолды имели следующие характеристики:– средний диаметр волокон 150–200 нм;– поверхностная плотность ~2 г/кв.м.– соотношение компонентов скаффола составляло ПКЛ/ГА – 95 : 5% помассе.2.1.2.
Организация экспериментов с лабораторными животнымиИсследования проведены на 90 белых нелинейных крысах-самцах массой180–220 г.Экспериментальные животные содержались на обычном пищевом рационе встандартных условиях (12-часовой период освещения, комнатная температура 18–22 °С, влажность 50–70%) на базе вивария ФГБОУ ВО «Саратовский42государственный аграрный университет им.
Н.И. Вавилова» Министерствасельского хозяйства РФ. При проведении эксперимента все животные находилисьв одинаковых условиях, в отдельной лаборатории при постоянной температуре состандартным уровнем освещения, исключающей посторонние раздражители.Выполненная экспериментальная работа была проведена в соответствии спринципами биоэтики, Конвенцией по защите животных, используемых вэксперименте и других научных целях (принятой Советом Европы в 1986 г.),приказом МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 «Об утверждении правил лабораторнойпрактики».
Исследование соответствует этическим нормам, изложенным вЖеневской конвенции (1971), Международных рекомендациях по проведениюмедико-биологическихисследованийсиспользованиемживотных(1985),Хельсинской Декларации по вопросам медицинской этики и Международнымрекомендациямпопроведениюмедико-биологическихисследованийсиспользованием лабораторных животных (1989).2.1.3. Методика субкутанной имплантации скаффолдов у животныхПодготовительная частьвключала эпилирование зоны имплантацииэкспериментальных скаффолдов за сутки до оперативного вмешательства укаждого животного.Для достижения наркоза крысам за 5 минут до проведения оперативноговмешательства вводилась внутримышечно комбинация золетила-100 («VirbacSante Animale», Франция) в дозе 0,05 мл/кг и ксилазина («Interchemie»,Нидерланды) в дозе 1 мг/кг (ВИДАЛЬ «Ветеринарные препараты в России»,2015).Проводилась обработка операционного поля в области холки животныхраствором BETADINE (EGIS Pharmaceuticals, Венгрия) трижды.
Имплантациюскаффолдов проводили по методике (Dorj B. et al., 2013). Для этого проводилиразрез кожи в межлопаточной области длиной 15 мм, после чего в подкожножировой клетчатке остро и тупо формировался «карман». Скаффолды толщиной430,1 мм в форме диска диаметром 15 мм помещали в карман, после чего на ранунакладывались швы.Уложнооперированныхживотныхпроводилосьоперативноевмешательство соответствующего объема, но без имплантации скаффолда.2.1.4. Объекты исследования микроциркуляции кожи при субкутаннойимплантации скаффолдовИсследование микроциркуляции в сосудах кожи и механизмов егомодуляции проведено на 3-х группах крыс-самцов:I группа (n = 10) – группа сравнения – включала животных, которымпроводилосьхирургическоевмешательство,включающееформирование«кармана» в подкожной клетчатке и наложение швов, но без имплантациискаффолда.II группа (n = 10) – группа отрицательного контроля – включала животных,которым выполнялась подкожная гетеротопическая имплантация скаффолда наоснове ПКЛ, на поверхности которого был адсорбирован чужеродный белок сцельюпровокациивоспалительнойреакции(скаффолд,необладающийбиосовместимостью).III группа (n = 10) – животные с проведенной подкожной гетеротопическойимплантацией скаффолда на основе ПКЛ и ГА в область холки.2.1.5.
Объекты гистоморфологического исследования при субкутаннойимплантации скаффолдовС целью оценки морфологической картины тканевых реакций и динамикизаселения матриц клетками соединительной ткани проводили исследованиепрепаратов мягких тканей зоны имплантации скаффолда или же областиимитации имплантации (области оперативного вмешательства у животныхгруппы сравнения) у 90 животных, разделенных на три группы, как описано впредыдущем разделе. Выведение животных из опыта осуществляли путемдекапитации по 10 особей из каждой группы на 7, 14 и 21-е сутки эксперимента.442.1.6.Объектыбиохимическогоисследованияприсубкутаннойимплантации скаффолдовС целью определения активности воспалительного процесса и механизмоврегуляции ангиогенеза при имплантации скаффолдов проводили биохимическиеисследования сыворотки крови трех групп животных.
Для биохимическогоисследования получали сыворотку из крови, взятой у животных пункцией правыхотделов сердца с последующим 15-минутным центрифугированием при 3 тыс. об.в минуту. Забор крови у животных производили непосредственно перед выводомиз эксперимента во всех группах на 7, 14, 21-е сутки.2.2. Методы исследования2.2.1. Исследование изменений микроциркуляции кожи над зонойимплантации или имитации имплантации скаффолдовИзменениямикроциркуляциипроводилосьметодомлазернойдопплеровской флоуметрии (ЛДФ) с помощью компьютеризированного лазерногоанализатора микроциркуляции крови «ЛАКК-ОП» (производство НПП «Лазма»,Россия) с использованием программы LDF 2.20.0.507WL.Перед регистрацией ЛДФ-граммы проводилась проверка «нулевого»показания анализатора.
Для этого рабочий торец зонда с насадкой устанавливалсяперпендикулярно внутренней поверхности белого диска из фторопласта,вращением ручки «уст. нуля» на передней панели добивались нулевого показанияна индикаторном табло. Проверка «нулевого» показания анализатора «ЛАККОП» проводилась с целью повышения достоверности получаемых результатов.Металлическая насадка со световодным зондом фиксировалась на области холкиживотного, непосредственно над зоной имплантации или имитации имплантациискаффолда при помощи атравматического пластыря. Изменения потока крови вмикроциркуляторном русле кожи животного регистрировались в виде кривой(ЛДФ-граммы), отображаемой на экране монитора компьютера, сопряженного с45анализатором «ЛАКК-ОП». Длительность стандартной записи составляла 8 минути осуществлялась на 7, 14 и 21-е сутки эксперимента.Расчет параметров базального кровотока проводился в два этапа.
На первомэтапе рассчитывали показатель перфузии (М) – величина среднего потока крови винтервалах времени регистрации или среднее арифметическое значение перфузиив перфузионных единицах (пф. ед.). Типичный вид кривых, отражающихизменение потока крови в микроциркуляторном русле у белых крыс-самцов,представлен на рис. 1.Рис. 1. Кривая изменения перфузии микроциркуляторного русла кожи(ЛДФ-грамма) интактного крысы-самцаНа втором этапе проводился вейвлет-анализ ЛДФ-граммы с использованиемпрограммного обеспечения LDF версии 3.0.2.395. При изучении активныхмеханизмов модуляции микроциркуляции с помощью спектрального вейвлетанализа оценивали величины пиковых частот, абсолютных и нормированныхамплитуд осцилляций в эндотелиальных (0,01–0,076 Гц), нейрогенных (0,076–0,2 Гц) и миогенных (0,2–0,74 Гц) диапазонах (Humeau A.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
