Автореферат (1154824), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Самара (зав. лабораторией — канд. биохим. наукЖелтякова О.В.).Диссертационное исследование проводили в два этапа:экспериментальный иклинический. На первом этапе выполнено экспериментальное изучение роли кисспептина врегуляции эстрального цикла крыс (модельный эксперимент). Первый этап состоял из 3 частей.В первой части были отобраны 36 половозрелых самок крыс линии Wistar в возрасте 6 месяцев,весом 195,0 ±10,0 г, с синхронизированными эстральными циклами.
Все животные былиразделены на 2 группы (опыт и контроль).Оценку фаз эстрального цикла крыс проводили, используя цитологическое исследованиевлагалищных мазков. Забор влагалищного отделяемого осуществляли с помощью марлевоготампона, ежедневно, на протяжении 4-х недель. Микроскопическое исследование с цельюопределения индекса созревания (ИС) и кариопикнотического индекса (КИ) выполняли приувеличении 10х20 с окраской материала 0,5% спиртовым раствором метиленового синего. Выборкрыс линии Wistar в качестве модели для эксперимента был определен аллометричностьюфункционирования репродуктивной системы крысы и человека и общими закономерностямипроцессов инволюции половой сферы (Salehi M.S.
et al., 2013).В ходе второй части исследования с целью изучения влияния на эстральный цикл крысблокады кисспептинергических рецепторов животным из опытной группы (18 особей) вводили вносовые ходы блокатор кисспептинергических рецепторов — kisspeptin-234 trifluoroacetatesalt6(Sigma, USA), 10 мкл раствора (2х10-3 моль).
Для чистоты моделирования эксперимента вконтрольной группе (18 особей) вводили такой же объем 0,9% раствора NaCl (10 мкл).Результаты оценивали путем измерения базальной температуры и микроскопии влагалищныхмазков на протяжении не менее 10 суток.В третьей части эксперимента изучали стимулирующее влияние кисспептина на«заблокированный» эстральный цикл крыс, для чего на фоне пролонгированного в 2 разадиэструса животным из опытной подгруппы вводили 10 мкл раствора kisspeptin-234(2х10-2 моль). Животным контрольной группы вводили аналогичный объем 0,9% раствора NaCl.Регистрировали базальную температуру крыс, выполняли микроскопическое исследованиевлагалищного отделяемого на протяжении 4 дней ежедневно (метод Стоккарда и Папаниколау).Для микроскопии использовали микроскоп «XS-910» (ОМО, Россия, 2011) с увеличением 10х20,оснащенный цифровой насадкой для компьютерной визуализации изображения DCM130(Shangrao Tele View Optical Instruments, Китайская Народная Республика, 2011).
Увеличениефазы диэструса с 2 до 5 дней расценивали как «экспериментальное нарушение эстральногоцикла», то есть отсутствие овуляции.В клиническую часть работы были включены 237 женщин в возрасте от 18 до 35 лет,распределенных по четырем группам. Исследование было выполнено на базе Самарскойобластной клинической больницы имени В.Д.
Середавина (гл. врач — Купцов Д.Н.) и Лечебнодиагностического комплекса «МЕДГАРД» г. Самара (гл. врач — Мокеев А.Г.).I группу составили 82 женщины, не планировавшие и не имевшие беременностей,живущие регулярной половой жизнью и использовавшие с целью контрацепции презерватив.Во II группу вошли 85 женщин, ранее не страдавших бесплодием, имевших 1–2беременности, закончившиеся нормальными родами, и на момент обследования живущихрегулярной половой жизнью с использованием презерватива с целью контрацепции.III группу сформировали из 37 здоровых беременных женщин, имевших 1–2беременности, включая настоящую.IV группу составили 33 женщины, страдавшие первичным и/или вторичным бесплодиемнеустановленного генеза в течение 5 лет и более.
Эти пациентки были обследованы в объеме,необходимом для ЭКО, в сроки не ранее чем через 1–2 месяца после отмены гормональныхпрепаратов.Критериями исключения служили:• пороки развития мочеполовой системы;• острые и обострение хронических специфических и неспецифических воспалительныхзаболеваний женских половых органов на момент обследования;• болезни эндокринной системы, нарушения питания и обмена веществ;7• сниженный овариальный резерв;• онкологические заболевания, в том числе в анамнезе;• аутоиммунные, неврологические, психические заболевания;• соматические заболевания тяжелой и средней степени тяжести, а также любыезаболевания в стадии обострения;• наличие зарегистрированных профессиональных вредностей, хронических стрессов,тяжелого физического труда, в том числе труда в экстремальных для организма условиях;• нерегулярная половая жизнь;• изменения в спермограмме у супруга.Уровень кисспептина сыворотки крови определяли методом иммуноферментного анализас использованием спектрофотометра Sunrise–Tecan (Австрия, 2013 г.) и набора реактивовкисспептин-54 (метастин) (с экстракцией) (BCM DIAGNOSTICS, США).Забор крови с целью определения уровня кисспептина выполняли у женщин I и II групп —вне менструации; в III группе — с 12 по 39 неделю беременности с интервалом в 12–14 недель; вIV группе — однократно.Исследовали уровни гормонов: ФСГ (мЕд/мл=Ед/л); ЛГ (мЕд/мл=Ед/л); прогестерона(нмоль/л); эстрадиола (нмоль/л); пролактина (мЕд/л) методом электрохемилюминесценции наавтоматическом анализаторе Cobas с601 (Roche, Швейцария, 2013 г).
За референсные значенияуровня гормонов крови принимали: в фолликулярную фазу: ФСГ равен 1,37-9,90 мЕд/мл; ЛГ=21,9-56,6 мЕд/мл; пролактин = 79-347 мЕд/мл; эстрадиол = 68-1269 пмоль/л; прогестерон = 0,302,20 нмоль/л. В лютеиновую фазу ФСГ равен 6,17-17,20 мЕд/мл; ЛГ =1,68-15,00 мЕд/мл;пролактин = 79-347 мЕд/мл; эстрадиол = 131-1655 пмоль/л; прогестерон = 0,5-9,4 нмоль/л.Положения, выносимые на защиту:1. Блокада кисспептинергических рецепторов в эксперименте приводит к нарушениюовуляции у молодых половозрелых самок крыс линии Wistar с устойчивым эстральным циклом.Экзогенноевведениекисспептинакрысам,находящимсявдиэструсе,способствуетвосстановлению овуляции.2. Содержание кисспептина в крови у здоровых женщин коррелирует с уровнямигонадотропинов и половых гормонов (r=0,98), что подтверждает его важную роль в регуляциифункции женской репродуктивной системы.
Референсные значения кисспептина у здоровыхнебеременных женщин составляют 2,5 нг/мл и более.3. Кисспептин может использоваться в качестве маркера риска бесплодия, связанного сотсутствием овуляции. Двукратное снижение уровня кисспептина в сыворотке кровиувеличивает риск ановуляторных циклов в 4 раза (с вероятностью 98%).8Степень достоверности и апробация результатов работы. Статистическая обработкаданных была выполнена в автоматическом режиме с применением пакета прикладных программStatistica for Windows 6,0.
При сравнении показателей использовали критерий Стьюдента.Различия считали достоверными при р <0,05.Апробация состоялась на расширенном заседании кафедры акушерства и гинекологии скурсом эндоскопической хирургии Медицинского университета «Реавиз» (г. Самара) 18 мая2016г., протокол №7.Основные положения диссертации доложены, обсуждены и одобрены на: VI Ежегоднойнаучной конференции молодых ученых и специалистов «Репродуктивная медицина: взглядмолодых» (Санкт-Петербург, 2015); V Всероссийской конференции с международным участием«Медико-физиологические проблемы экологии человека» (Ульяновск, 2014); Международнойконференции «Инновационные медицинские технологии» (Москва, 2015).
По результатамисследования автором получены патент на изобретение №2574669 «Способ экспрессдиагностики женского эндокринного бесплодия» и патент на изобретение № 2571896 «Способмоделирования женского ановуляторного бесплодия на крысах».Теоретические положения о роли кисспептина в регуляции функции репродуктивнойсистемы женщины внедрены в учебный процесс кафедр медико-биологических дисциплин,акушерства и гинекологии и в работу клинико-диагностических лабораторий Медицинскогоуниверситета «Реавиз» (г. Самара, г.
Москва).Разработанные прогностические критерии риска бесплодия, связанного с отсутствиемовуляции, внедрены в практическую работу Лечебно-диагностического комплекса «Медгард»,г. Самара; СПб ГБУЗ «Городская поликлиника № 77 Невского района», г. Санкт-Петербург;Санкт-Петербургскую Клинику имени Н. И.
Пирогова, г. Санкт-Петербург.Автор лично спланировала исследование, сформулировала его цель и задачи, выполнилаобзор литературы по тематике диссертации. В ходе сбора материала участвовала в обследованиии наблюдении 237 пациенток, самостоятельно выполнила экспериментальный этап работы.Эффективно применила методы статистической обработки и анализа полученных результатовисследований,сформулировалавыводыиразработалапрактическиерекомендации,опубликовала основные положения диссертации.По результатам работы автор имеет 13 публикаций, в том числе 7 — в рецензируемыхжурналах, рекомендованных ВАК РФ.Диссертация изложена на 107 страницах машинописного текста.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
