Автореферат (1154487), страница 2
Текст из файла (страница 2)
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯМатериал для исследования был собран в 15-ти пунктах,охватывающих разные ландшафтные зоны (рис.1). Основные исследованияпроводились на юге лесостепи Среднерусской возвышенности (пункты № 28, 11). Часть выборок была сделана в зоне широколиственных лесов(Московская область, пос. Быково, пункт № 12), в зоне хвойношироколиственных лесов (г. Тверь, пункт № 1), в зоне смешанных ишироколиственных лесов Приднепровской возвышенности (г. Киев, пункт №10) и Полесской низменности (г. Житомир, № 9), а также в ЦентральнойЕвропе из окрестностей городов Прага (пункт № 13), Буковце (пункт № 14) иВроцлав (пункт № 15).Ввиду особого охранного статуса исследуемого вида, дляэкспериментального анализа у животного отщипывали небольшой фрагментноги, избегая тем самым его умерщвления.В качестве маркеров популяционной структуры H.
pomatia нами былииспользованы метрические и фенетические признаки раковины, локусыаллозимов и межмикросателлитные (ISSR) участки ДНК.Измерение раковин моллюсков осуществляли при помощиштангенциркуля с точностью до 0,1 мм. Анализу подвергали толькораковины особей, закончивших рост и имеющих отворот устья. Измерениеконхиологических параметров раковины производили по стандартной схеме(Шилейко, 1978) с небольшими изменениями: измеряли большой диаметрраковины (БДР), высота раковины (ВР), высота устья (ВУ), ширина устья(ШУ), высота завитка (ВЗ), ширина завитка (ШЗ).
Далее вычисляли объемраковины (V=ШР2×ВР/2) и площадь устья (S=3,145×ВУ×ШУ/4) (Rensch,1932). Также рассчитывали индексы ВР/БД, ВУ/ШУ, ВЗ/ВР, ВЗ/ШЗ и V/S.6Фенетический анализ проводили по комбинации и степенивыраженности пяти продольных коричневых лент на раковине.
Лентынумеровали от 1 до 5, если полоса отсутствовала, то ставили цифру 0. Номераслившихся полос заключали в скобки (Крамаренко, Крамаренко, 2009 и др.).После этого оценивали частоту каждой морфы в популяции, вычислялисреднее число морф (µ), частоту редких морф (h), а также рассчиталипоказатель сходства популяций по фенетическим признакам (r)(Животовский, 1979, 1991).Рис. 1 Пункты сбора H. pomatia: 1 – «Тверь», 2 – «Шопино», 3 –«Курск», 4 – «Донец», 5 – «Хотмыжск», 6 – «Майский», 7 – «Белгород», 8 –«Харьков», 9 – «Житомир», 10 – «Киев», 11 – «Яблоново», 12 – «Быково», 13– «Прага», 14 – «Буковце», 15 – «Вроцлав»Электрофорез изоферментов проводили в вертикальных пластинах 10%полиакриламидного геля (ПААГ) по общепринятой методике (Остерман,1981). В качестве генетических маркеров использовали два локусамономерных эстераз (EST3 и EST4 с тремя аллелями каждый), димерныйлокус супероксиддисмутзы с двумя аллелями (SOD1) и димерный локусмалатдегидрогеназы с двумя аллелями (MDH1) (Снегин, Артемчук, 2014).Анализ полиморфизма ДНК проводили с использованиемполимеразной цепной реакции методом ISSR (Inter Simple Sequence Repeats)(Zietkiewicz et al., 1994).
ДНК выделяли согласно протоколу наборареактивов Silica uni на основе сорбента (Biokom, Россия). Для исследованиябыли использованы праймеры: UBS-809 (5׳-(AG)8G-3)׳, UBS-811 (5׳-(GA)8C3)׳, UBS-827 (5׳-(AC)8G-3)׳. Амплификацию проводили в термоциклерах MJMini и MyCycler (Bio-Rad, США). Продукты ПЦР разделяли с помощьюэлектрофореза в 2 % агарозном геле с использованием ТАЕ буфера. Блокиокрашивали бромистым этидием. По картинам амплифицированных7фрагментов, полученных в ходе электрофореза, составляли бинарныематрицы, где присутствие полосы обозначалось как «1» (аллель p),отсутствие «0» (аллель q).
У H. pomatia нами диагностировано 57 локусов.Степень устойчивости популяций H. pomatia к действиюгенотоксичных ксенобиотиков среды определяли с помощью методащелочного гель-электрофореза изолированных клеток (метод ДНК-комет)(Rydberg, Johanson, 1978). При этом из анализируемых групп отбирали по 10особей, в каждой из которых анализировали не менее 100 ядер.
Ядраранжировали по пяти степеням разрушения ДНК. Анализ изображенийпроводили в программе CometScoreTM. В дальнейшем полученные данныеиспользовали для расчета индекса ДНК-комет (Struwe et al., 2007):ИДК=(0n0+1n1+2n2+3n3+4n4)/∑, где n0-n4- число «ДНК-комет» каждого из 5условных типов, а ∑- общая сумма подсчитанных комет. Дополнительно, накаждом препарате мы учитывали клетки, находящиеся в состоянии апоптоза.Всего по морфометрическим показателям изучено 1109 особей, поаллозимам – 499 особей, по ДНК-локусам – 511 особей. Ввиду того, что впункте № 11 «Яблоново» найдено всего 3 живых особи, анализ этой группыбыл проведен только по конхиологическим признакам.
В пунктах № 13«Прага», № 14 «Буковце», № 15 «Вроцлав» собранный материал представлялсобой заспиртованные фрагменты животных, поэтому исследования былипроведены только по ДНК-локусам.Статистическую обработку полученных данных проводили припомощи пакетов программ Statistica 6 (TL 835), GenAlEx (Peakall, Smouse,2006), PорGene 1.32 (Yeh et al., 2000) и MEGA6 (Tamura et al., 2013).ГЛАВА 4. ФЕНЕТИЧЕСКИЙ И МОРФОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗПОПУЛЯЦИЙ HELIX POMATIAСогласно полученным данным, подавляющее большинство изученныхпопуляций оказались фенетически сходными, с преобладанием в них феновсо слившимися 2 и 3 лентами (табл.
1). В общем популяционномразнообразии на долю межпопуляционных отличий пришлось лишь 2 %изменчивости, при этом индекс подразделенности популяций Фst=0,024.Наибольшие разнообразие комбинаций отмечено в группах из г. Киев и пос.Хотмыжск Белгородского области. Самой мономорфной оказалась группа изпос. Майский. По результатам расчетов показателя фенетического сходства(r) наименьшие фенетические дистанции (r=0,999) отмечены междугруппами, «Курск»-«Майский» и «Яблоново»-«Майский», «Курск»«Яблоново».
Дальше всех дистанцировалась группа из г. Тверь (rсред=0,836).Таким образом, анализ фенотипического облика популяций H. pomatiaпозволил с одной стороны говорить о сходных генетических процессах,протекающих в изучаемых группах, а с другой стороны, позволил выявитьнаиболее оригинальные по данным признакам популяции, что отчастиговорит об их происхождении и различиях векторов естественного отбора.8Таблица 1Частоты фенотипов и показатели фенетического разнообразия впопуляциях Helix pomatiaФенотипы123451(23)4510345(123)451(234)50(23)4502345μ±Sμ10,2860,4290,0000,2860,0000,0000,0002,971±1,3080,576h± Sh±0,187N720,0590,8330,0000,0000,0830,0000,0002,085±0,5490,702±0,0783430,2260,7740,0000,0000,0000,0000,0001,836±0,5530,738±0,0793140,2200,6600,1200,0000,0000,0000,0002,650±0,4800,621±0,0695050,2290,6570,0570,0570,0000,0000,0003,122±0,5880,554±0,08435Пункты670,191 0,3150,809 0,6760,000 0,0000,000 0,0000,000 0,0000,000 0,0000,000 0,0091,786 2,186±0,370 ±0,3080,745 0,688±0,053 ±0,0446811180,0850,8310,0140,0700,0000,0000,0002,516±0,3990,641±0,0577190,1320,8420,0000,0260,0000,0000,0002,081±0,5190,703±0,07438100,2220,6890,0000,0000,0440,0220,0223,277±0,5210,532±0,07445110,2000,8000,0000,0000,0000,0000,0001,800±0,5170,743±0,07435120,0950,8570,0000,0480,0000,0000,0002,110±0,7010,699±0,10021Примечание: µ - среднее число морф, h - доля редких морф (Животовский, 1991).Пункты: 1-«Тверь», 2-«Шопино», 3-«Курск», 4-«Донец», 5-«Хотмыжск», 6-«Майский», 7«Белгород», 8-«Харьков», 9-«Житомир», 10-«Киев», 11-«Яблоново», 12-«Быково»Несколько иной результат был получен по конхиметрическимпоказателям (табл.
2).Таблица 2Значения метрических признаков раковины в колониях H. pomatia(мм, M±∆, Р<0,05, обозначение популяций как в таблице 1)Пункт N1722431444052966567167861938103111261215ВРБДРВУШУВЗШЗ37,5±2,438,3±0,742,8±1,137,6±0,636,9±0,738,3±0,335,0±0,635,3±0,940,2±0,936,1±1,238,3±1,236,9±1,536,6±2,439,9±0,841,6±1,137,5±0,837,3±0,736,3±0,333,4±0,535,5±0,738,8±1,034,5±1,240,0±1,137,0±1,227,8±1,127,4±0,630,2±0,926,2±0,425,9±0,526,9±0,223,7±0,425,1±0,427,6±0,825,1±0,728,3±0,726,6±0,624,5±2,524,7±0,826,7±0,923,7±0,523,8±0,522,9±0,220,3±0,419,1±0,725,1±0,621,9±0,824,0±0,723,6±1,310,9±1,112,1±0,613,4±0,913,0±1,411,2±0,411,4±0,211,3±0,410,6±0,912,5±0,510,9±0,710,4±0,611,9±0,427,2±1,829,5±0,630,8±0,927,5±0,927,6±0,726,9±0,325,5±0,525,0±0,829,4±1,025,3±0,926,5±0,726,5±0,9ВЗ/ШЗ0,40±0,020,41±0,020,43±0,020,47±0,040,40±0,010,42±0,010,44±0,010,42±0,040,43±0,020,43±0,020,39±0,020,45±0,01ВЗ/ВР0,29±0,010,31±0,010,31±0,010,34±0,040,30±0,010,29±0,010,32±0,010,28±0,010,31±0,010,30±0,010,27±0,020,32±0,01ВР/БДР1,02±0,030,96±0,011,03±0,021,01±0,020,99±0,011,05±0,011,05±0,010,99±0,011,03±0,021,04±0,010,96±0,020,995±0,010ВУ/ШУ1,16±0,121,12±0,061,13±0,021,11±0,011,09±0,011,19±0,011,18±0,021,32±0,081,10±0,021,15±0,031,18±0,021,14±0,04VSV/S25635,0±4751,630698,0±1702,837331,8±2799,026661,9±1349,925805,6±1439,026092,2±615,020043,9±813,322662,7±1387,234040,2±1926,122017,6±2030,430957,4±2345,225944,2±2652,9534,1±56,3532,5±24,4634,4±37,2489,8±16,4485,0±19,4489,4±8,5381,5±13,1379,1±18,6581,7±26,0434,5±26,0534,7±26,4498,4±38,747,5±4,558,1±4,058,7±2,154,3±1,853,0±1,352,5±0,652,4±1,461,0±5,058,5±1,550,0±2,457,6±2,751,3±1,39Согласно однофакторному дисперсионному анализу (ANOVA), по всемпризнакаммежпопуляционныевариансыдостовернопревзошливнутрипопуляционные (P<0,05).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
