Диссертация (1154473), страница 13
Текст из файла (страница 13)
Низкие показатели параметра PIABS (индекс производительности) уобработанных хромат-ионами водорослей указывают на низкую функциональнуюактивность ФС II, в основном из-за снижения доли активных РЦ и повышениятушения возбужденных состояний в антенне. Уменьшение эффективностипередачи энергии возбуждения со светособирающего комплекса на РЦ должносопровождаться увеличением рассеивания неиспользуемой световой энергии.Действительно, эффективность рассеивания энергии (DIО/RC) у клеток вприсутствии хромат-ионов находится на высоком уровне. Это коррелирует сувеличением у них ΔpH-зависимого нефотохимического тушения qE, котороерассчитывается по спаду флуоресценции после достижения максимума (qE = (FM –F6s)/FV). Увеличение нефотохимического тушения отмечено и при регистрацииметодом РАМ - флуорометрии у зеленых пресноводных водорослей в работе(Khalida et al., 2012).
Параметр ABS/RC у клеток в присутствии хромат-ионовувеличен относительно контроля, что связано со снижением у них доли активныхРЦ. В работе с Lemna gibba также было продемонстрировано увеличениеразмеров антенны на РЦ в присутствии хромат-ионов, которое связали снарушением биосинтеза белка D1 (Ali et al., 2006).
На ряске показано, что солихрома могут влиять на кислородвыделяющий комплекс (КВК) (Ali et al., 2006). Внаших экспериментах снижение параметра FV/FO, отвечающего за изменения вэффективности расщепления воды в ФС II (при концентрациях 15 и 25 мг/л),также указывает на возможность воздействия соединений хрома на этом участкеКВК (Габбасова с соавт., 2017).85Ранее отмечалось, что в условиях стресса, вызванного различнымипричинами (Гольцев с соавт., 2014; Lazar, 2006; Strasser et al., 2010), на кривыхфлуоресценции (примерно на 300 мкс) наблюдается резкий переход от фазы O – Jк фазе J – I, с образованием “ступеньки” или даже дополнительного пика К.
ЭтотК-пик связывают с нарушениями на донорной стороне ФС II. Он проявляется привычитании контрольных кривых из кривых с разрушенным КВК при действиизагрязнений. В присутствии хромат-ионов на кривой флуоресценции такжеобнаруживается К-пик, описываемый параметром VK (Таблица 3), которыйуказывает на нарушения в процессе разложения воды. Ингибирование КВК можеттакже влиять на транспорт электронов ФС II. В литературе K-пик появлялся улистьев, подверженных тепловому стрессу и у естественно выращенных растенийв стрессовых условиях (Liu et al., 2006; Srivastava et al., 1997; Strasser, Strasser,1995). K-пик был отмечен у Cycus revoluta, Juniperus, произраставшими в жаркомклимате.
Другой пример присутствия K-пика наблюдалось у красных жгутиковыхи спор Haematococcus (Srivastava et al, 1997). K-пик появляется из-за поврежденияКВК. Поврежденный КВК ингибирует электронный транспорт с Фео до QA, иприводит к накоплению 680+ Фео-. Это может быть также связано с накоплениемокисленных вторичных электронных доноров ФС II. Ингибирование КВК можетявляться результатом сокращения количества реакционных центров (РЦ),отвечающих за электронный транспорт электронов ФС II (φEo). Вследствие этогосокращение РЦ может привести к увеличению размеров антенны РЦ (ABS/RC),что в свою очередь ведет к усилению рассеивания энергии (DIО/RC).
В работе сLemna gibba было продемонстрировано соответствие увеличения размеровантенны на РЦ в присутствии хрома с биосинтезом белка D1. Разрушение белкаD1 и дальнейшее снижение электронного транспорта, по-видимому, связано споявлением активных форм кислорода (Габбасова с соавт., 2016).Измерения таких величин как FV/FM (максимальный квантовый выход ФС II)и PIABS (индекс производительности) - показателей функциональной активностиФС II установили, что хромат-ионы вызвали инактивацию ФС II, что согласуется86с данными об их токсическом действии на ФС II, полученными ранее для другихфотосинтетических объектов (Didur et al., 2013; Horcsik et al., 2007).МиллисекунднаяЗФвозникаетврезультатевторичнойреакциирекомбинации, а ее интенсивность зависит от величины электрохимическогоградиента протонов на тилакоидной мембране, энергия которого снижает энергиюактивации реакции обратной рекомбинации (Гольцев с соавт., 2014; Маторин,Рубин, 2012; Oukarroum et al., 2013).
Определение параметров ЗФ является однимиз методов, который позволяет следить за изменением градиента протоновфотосинтетическоймембраныклетки.МаксимумнакривойЗФвмиллисекундном диапазоне совпадает с фазой возрастания J на индукционнойкривой быстрой флуоресценции (Рисунок 26 Б). Образование этого пикаобусловлено накоплением излучательных редокс-состояний, отвечающих заобратную рекомбинацию зарядов и испускание квантов ЗФ (т.е. высвечивающиесостояния), а также усилением ЗФ за счет образующегося электрическогопотенциала на мембране (Δψ). Пик ЗФ в секундном диапазоне связывают сфотоиндуцированным образованием трансмембранного градиента протонов(ΔpH), который также снижает энергию активации излучательных переходов(испускание ЗФ) в РЦ ФС II.
Эти закономерности рассмотрены во многих работах(Гольцев с соавт., 2014; Oukarroum et al., 2013). У клеток в присутствии хроматионов значительно снижена интенсивность ЗФ на индукционной кривой при 10–50 мс и 1 c (Рисунок 26 Б), что, вероятно, связано со значительным уменьшениемнециклического транспорта и, соответственно, уменьшением энергизациифотосинтетических мембран. Изменения выхода ЗФ в течение индукционногопериода зависит от формирования электрического и протонного градиента черезмембрану. Различают быструю и медленную фазы индукционных кинетик ЗФ.Быстрый компонент показал два пика, I1 ~10 мс и I2 на ~ 100 мс, после чего ЗФснижался до минимума (Рисунок 26 Б).
Предполагается, что быстрый компонентотражает формирование переходного электрического градиента через мембрану.Медленный компонент появляется после промежуточного короткого максимума(I3). Медленный компонент представлен несколькими пиками, такими как I4, I5, I687и длится несколько секунд после начала освещения. Эти изменения связаны, восновном, в свето-индуцированной генерации ΔpH.
Пики кривой ЗФ таких как I1,I2, I3, I4, I5, I6 были снижены в морских микроводорослях P. tricornutum вприсутствии ионов хрома, что свидетельствует об уменьшении формированияэлектрического и протонного градиента через тилакоидную мембрану (Рисунок26 Б).Измерение модулированного отражения при 820 нм позволяет следить зареакциями Р700 (пигмент ФС I).
Максимум накопления наблюдался при t ≈ 30 мс(MRmin), который потом сменялся восстановлением Р700 (Рисунок 26 В). При этомсигналыфлуоресценции,отражающиевосстановлениеQА,ипроцессывосстановления Р700 выходят на плато примерно синхронно. Параллельноенакопление восстановленных форм Р700 и QА отражает восстановлениепереносчиков на всем участке ЭТЦ между фотосистемами в связи с отсутствиемоттока электронов из акцепторной части ФС I в условиях, когда ферредоксинНАДФ-редуктаза (ФНР) инактивирована инкубацией в темноте.
При длительномосвещении (~1–10 с) наблюдали вторую волну окисления Р700, которую можнообъяснить оттоком электронов от ФС I при активации ФНР и ферментов циклаКальвина. Как видно из рисунка 26 В, водоросли при обработке низкимиконцентрациями хромат-ионов сохраняют способность Р700 к окислению привключении света. Однако у них наблюдалось снижение скорости восстановленияР700 от ФС II.
Это согласуется с данными анализа индукционных кривыхбыстрой флуоресценции. При больших концентрациях наблюдается существенноеподавление реакций окисления Р700 в ФС I.Для более детального изучения влияния хромат-ионов на реакции ФС Iисследовали кинетику темнового восстановления после освещения дальнимкрасным светом (см. Материалы и методы). Во время 20 мс освещения культурыводорослей актиничным светом с длиной волны 700 нм происходило накоплениесигнала P700+.Таблица 4.
Изменения амплитуды P700+ при освещении 20 мс (5000 мкмольквантов·м-2·с-1) и амплитуд быстрой и медленной компонент темнового88восстановления P700 у P. tricornutum при действии различных концентрацийK2Cr2O7 через 24 ч инкубации, в % от контроля.КонцентрацияK2Cr2O7, мг/лконтроль2,55101525Начальнаяамплитуда P700+после освещения10010887888770Быстраякомпонента1009089877667Медленнаякомпонента01011132433Анализ кинетик Р700 представляет собой мощный инструмент длямониторинга различных электрон-транспортных путей в ФС I. Окислительновосстановительные превращения Р700 складываются их трех экспонент, которыесоответствуют трем различным электронным потокам в ФС I.
Быстрая фазахарактеризует электронный поток от ФС II к Р700+. Средняя фаза отвечаетчастично за циклический электронный транспорт: электронные доноры с ФС I редуцированного ферродоксина до пула хинонов и наконец в ФС I. Медленнаяфаза представляет электронный поток к ФС I от стромальных доноров.Присутствие хромат-ионов в низкой концентрации (до 5 мг/л) не влияло нанакопление сигнала P700+ (Таблица 4). Хромат-ионы уменьшали амплитудуокисления только при концентрациях выше 5 мг/л.
После выключения светапроисходило темновое восстановление (Рисунок 27). У необработанной культурывосстановление осуществляется за счет притока электронов от ФС II, а также засчет дополнительных источников от циклического транспорта электронов истромальных доноров (Wodala et al., 2012). Кинетические кривые восстановленияу водорослей были разложены на две компоненты экспоненты: быструюкомпоненту восстановления со временами около 0,5 мс, которая отражаетдонорство от пластоцианина в нециклическом транспорте, и более медленнуюкомпоненту восстановления с временной константой – 15 мс (Hope et al., 2000).Вторая компонента может отражать восстановление как от нециклического, так отциклического электронного транспорта (Hope et al., 2000; Solovchenko et al., 2015).89Рисунок 27. Влияние K2Cr2O7 на кинетику темнового восстановления P700+послеосвещения 20 мс (5000 мкмоль квантов·м-2·с-1) у микроводоросли P.tricornutum: 1- контроль, 2 – 6 – клетки, инкубированные в течение 24 ч вприсутствии K2Cr2O7 (2,5; 5; 10; 15; 25 мг/л, соответственно).Вприсутствиихромат-ионовпроисходилоснижениескоростивосстановления после выключения света, что согласуется с ранее полученнымиданными по скорости восстановления на М-РЕА-2.
Из рисунка 27 и таблицы 4видно, что происходило относительное снижение амплитуды быстрой фазывосстановления сигнала, что в свою очередь указывает на уменьшение потокаэлектронов от ФС II к P700+. Примечательно, что амплитуда медленной фазы сувеличением концентрации ионов хрома повышалась, и это, возможно,свидетельствует об увеличении скорости циклического электронного транспорта,что характерно для ответа на действия многих стресс-факторов (Solovchenko et al.,2015).
Возможно, вклад вносит и очень медленная фаза, которая представляетэлектронный поток к ФС I от стромальных доноров. Ранее подобный эффект былописан при действии меди на листья гороха (Wodala et al., 2012).Известно, что при действии повышенных интенсивностей света могутразвиваться процессы фотоингибирования фотосинтеза, и происходит включениезащитныхпроцессов безызлучательной диссипацииизбыточнойсветовойэнергии. Поэтому для установления более полной картины влияния ионов хроманами было изучено его влияние на микроводоросли P.
tricornutum при различных90интенсивностей света, а также при различных режимах освещения. Как былопоказано в работе (Chow, Aro, 2005), фотоингибирование фотосинтеза связано, восновном, с распадом D1-белка, который кодируется геномом хлоропласта иявляется одним из основных компонент ФС II. Восстановление активности ФС IIсопровождаетсяресинтезомэтогобелкавхлоропласте.Очевидно,чтоконцентрация активных центров ФС I в клетках зависит от соотношенияскоростей ее фотоокислительной деструкции и репарации, которые могут бытьопределены по снижению величины FV/FM на интенсивном свету и еепоследующего восстановления в темноте, соответственно.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
