Диссертация (1151472), страница 9
Текст из файла (страница 9)
В качестве объектов исследований были выбраны 11 пород собак ввозрасте от 6 месяцев до 15 лет. Всего в исследованиях было использовано598пробы крови, в том числе для определения Т4, fТ4, Т3, fТ3, ТТГ -578проб, для определения биохимических показателей -20 проб сывороткикрови, на содержание билирубина общего, билирубина свободного, АСТ,АЛТ, мочевины, креатинина, общего белка, альбумина, щелочной фосфатазы,а-амилазы, глюкозы, ЛДГ, ГГТ, холестерина, триглицеридов, калия, фосфора,кальция, железа, магния от 129 собак.Исследование проведено в 7 этапов. Схема исследования представлена нарис.1.48Рис.1.Схема исследованийВсе исследованные собаки были доморощенными, в качестве кормаполучали корма премиум класса фирмы “Проплан” в соответствии сфизиологическими потребностями. Воду все животные получали безограничения.Передклиническийосмотр,взятиемкровиметодомсобиралипальпациианамнез,проводилиисследовалисостояниещитовидной железы.
Самок исследовали в период анэструса, кобелей впериод полового покоя. Животных подбирали в группы по методу группаналогов.В первой серии опытов определяли влияние возраста на функциональнуюактивностьщитовиднойжелезы.Данныеприведенывтаблице1.49Исследования проведены на 85 клинически здоровых собак разных пород иполов. Собаки были разделены на четыре группы:1.собаки в возрасте от 6 месяцев до 12 месяцев.2.
собаки в возрасте от 1 года до 3 лет.3.собаки возраста от 3 лет до 6 лет.4. собаки в возрасте от 6 лет и старше.Таблица 1Схема опыта для определения функционального состояния щитовиднойжелезы собак в связи с возрастомОпыт11.(n=85)Возрастные Всегопериодыживотных23T4fT44T35fT3676 мес-1 год16161616161-3 года32323232323-6 лет23232323236 -15 лет1414141414Во второй серии опытов определяли влияние породы на функциональнуюактивность щитовидной железы. Исследования проведены на 30 клиническиздоровых самках в возрасте от 2 до 4 лет таких пород как: той-терьер, чаучау, лабрадор, курцхаар, акиту-ину, бордоский дог.
(табл.2)В третьей серии опытов определяли влияние пола функциональнуюактивность щитовидной железы. Исследования проведены на 20 клиническиздоровых собак мелких пород разного пола в возрасте 5-6 лет. (табл.3)50Таблица 2Схема опыта для определения функционального состояния щитовиднойжелезы собак в связи с породойОпытПородыВсегоT4fT4T3fT3животных12.(n=30)2Той-терьер310Лабрадор41051061071066666Курцхаар22222Чау-Чау22222Акита-ину66666Бордоскийдог44444Таблица 3Схема опыта для определения функционального состояния щитовиднойжелезы собак разных половОпытФункциональные T4fT4T345fT3особенности12363.суки10101010(n=20)кобели10101010В четвертой серии опытов определяли влияние овариогистерэктомии иорхидэктомии на функциональную активность щитовидной железы собак.(табл.
4)Исследование проведено на 40 клинически здоровых собак мелкихпород разного пола в возрасте от 5-6 лет.51Таблица 4Схема опыта для определения функционального состояния щитовиднойжелезы собак в связи с кастрациейОпытФункциональное ВсегосостояниеживотныхT4fT4T367fT3кобели суки1234584.До кастрации101020202020(n=40)После кастрации 101020202020В пятой серии опытовопределяли влияние суточных биоритмов нафункциональную активность щитовидной железы. Исследование проведенона 4 клинически здоровых сук пород курцхаар и лабрадор в возрасте от 5-6лет.
Для исследованиякровь брали из подкожной вены предплечья синтервалом в 4 часа: в 8-00,12-00,16-00,20-00,24-00,4-00. (табл.5)Таблица 5Схема опыта для определения функционального состояния щитовиднойжелезы у собак в связи с суточными ритмамиОпытвремяВсегоfT4fT3животных123455.8-00444(n=4)12-0044416-0044420-0044424-004444-0044452В шестой серии опытов исследовали функциональные особенностигипофункции щитовидной железы. Исследование проведено на 5 кобеляхпороды акита-ину в возрасте 2-3 года.
В данной группе были определеныбиохимические показатели сыворотки крови (билирубин общий, билирубинпрямой, АСТ, АЛТ, мочевина, креатинин, общий белок, альбумин, ЩФ, аамилаза, глюкоза, ЛДГ, ГГТ, холестерин, триглицериды, калий, фосфор,кальций, железо, магний.), определен уровень тиреотропного гормона(табл.6), а также подсчитан коэффициент (К) по формуле Ларсена дляподтверждения гипотиреоза.К=0,7хfT4– Холестерин,где fТ4- содержание тироксина свободного (нмоль/л) в сыворотке крови,Холестерин- содержание холестерина (ммоль/л) в сыворотке крови.
Есликоэффициент (К) менее минус четырех, то гипотиреоз подтверждается. Есликоэффициент (К) в диапазоне от минус четырех до единицы, то этосомнительный диагноз на гипотиреоз, и при коэффициенте (К) большимединицы состояние эутиреоза. Контролем к ним были подобраны собаки тойже породы акиты-ину в возрасте 2-3 года без признаков гипотиреоза.Таблица 6Схема опыта для определения функциональной активности щитовиднойжелезы у собак с гипофункциейОпытФункциональноесостояние16.(n=11)Всегоживотных2T4fT4453T3fT367эутиреоз66666гипотиреоз55555В седьмой серии опытов проведена коррекция гипофункции щитовиднойжелезы собак с применением L-Тироксин 100, «Berlin-Chemie/ Menarini53Group, (Германия) в дозе 10 мкг/кг массы тела в сутки перорально на 5собаках.
Прием был разделен на два приема. По истечению 60 суток терапииживотные подвергались повторному клиническому осмотру. При этомоценивали биохимические показатели сыворотки крови (АСТ, АЛТ, ЩФ, аамилаза, глюкоза, ЛДГ, холестерин, триглицериды, магний.) и определялиуровень гормонов (Т4, fT4,T3,fT3,TTГ).Для исследованиякровь брали из подкожной вены предплечьявутренние часы (8.00-10.00) (исключение при исследование влияния суточныхбиоритмов) в количестве 5-6 мл, затем ее отстаивали в течение 30мин ицентрифугировали при 3000 об\мин в течение 20 мин.
Сыворотку отделяли,замораживали и хранили при t -20C до использования в исследованиях.Размораживаниеиповторноезамораживаниенедопускалось.Дляколичественного определения концентрации тироксина, трийодтиронина,ТТГ использовался метод твердофазного иммуноферментного анализа.Принцип метода заключается в том, что на внутренней поверхности лунокпланшетаиммобилизованыгормонам.Длямышиныеопределениямоноклональныетироксинаантителасоответственнокмышиныемоноклональные антитела к тироксину, для определения трийодтиронинасоответственно мышиные моноклональные антитела к трийодтиронину, дляопределения ТТГ мышиные моноклональные антитела к бета-цепи ТТГ.Гормоны из образца конкурируют с конъюгированными гормонами.
Врезультате образуется связанный с пластиком “сэндвич”, содержащийпероксидазу.Вотетраметилбензидинавремяинкубациипроисходитсокрашиваниерастворомрастворовсубстратавлунках.Интенсивность окраски обратно пропорциональна концентрации гормонов висследуемом образце. Концентрацию гормонов в исследуемых образцахопределяли по калибровочному графику зависимости оптической плотностиот содержания гормонов в калибровочных пробах. Для постановки ИФАиспользовали фотометр вертикального сканирования, позволяющий измерять54оптическую плотность содержимого лунок планшета при длине волны450нм,термостат, поддерживающий температуру +37 C±0,1C, дозаторы сосменными наконечниками, позволяющие отбирать объемы в диапазоне 25250 мкл; промывающее устройство.
Перед проведением анализа компонентынабора (рис.2) и исследуемые образцы сыворотки крови выдерживали прикомнатной температуре 30 мин. Вскрывали пакет с планшетом иустанавливали на рамку необходимое количество стрипов. Готовилиотмывочный раствор и коньюгат. Для проведения анализа помещали в рамкунеобходимое количество стрипов- исследуемые образцы в двух повторах и14лунокдлякалибровочныхпробиконтрольнойсыворотки.Всоответствующие лунки в дубликатах по 25 мкл калибровочной пробы иконтрольной сыворотки.
В остальные лунки вносили в дубликатах по 25 мклисследуемые образцы сыворотки крови собак. Далее вносили во все лунки по100 мкл коньюгата. Заклеивали планшет бумагой и инкубировали его втечение 60 минут при температуре +37 С. По окончанию инкубации удалялисодержимое лунок и отмывали лунки 5 раз. При каждой отмывке добавляливо все лунки по 250 мкл отмывочного раствора, встряхивали планшеткруговыми движениями по горизонтальной поверхности с последующейаспирацией.
При каждой аспирации тщательно удаляли остатки жидкости излунокпостукиваниемпланшетавперевернутомположениипофильтровальной бумаге. Во все лунки вносили по 100 мкл растворатетраметилбензидина. Инкубировали планшет в темноте при комнатнойтемпературе в течение 10-20 минут в зависимости от степени развитиясинего окрашивания. Вносили во все лунки по 100 мкл стоп-реагента, приэтом содержимое лунок окрашивается в ярко-желтый цвет.
Измеряливеличину оптической плотности содержимого лунок планшета на фотометревертикального сканирования при длине волны 450нм. В нашем исследованиимы использовали спектрофотометр “Униплан” фирмы “Picon.(рис. 3) Далеестроили в полулогарифмических координатах калибровочный график - по55оси абсцисс - десятичный логарифм концентрации гормона, по оси ординат –оптическая плотность калибровочных проб. Для алгоритма обсчетакалибровочногографикаиспользовалиинтервальныйметод.Покалибровочному графику определяли содержание гормонов в исследуемыхобразцах.Рис 2. Набор для иммуноферментного анализа фирмы ХемаРис.
3 Вертикальный спектрофотометр “Униплан ” фирмы “Picon”56Цифровыеданные,биометрически(ЛакинполученныеГ.Ф.,1990)внаэксперименте,персональномобработаныкомпьютересиспользованием прикладной программы ”SPSS 16”, с вычислением среднегоквадратичного отклонения, медианы, стандартной ошибки среднего, лимитови рассчитывали критерий Стьюдента. Зависимость показателей изучали спомощью коэффициента корреляции Пирсона. (Лакин Г.Ф.,1990г.) Вотдельных случаях проводили биохимические исследования сывороткикрови собак, определяли билирубин общий, билирубин прямой, АСТ, АЛТ,мочевина,креатинин, общий белок, альбумин, ЩФ, а-амилаза, глюкоза,ЛДГ, ГГТ, холестерин, триглицериды, калий, фосфор, кальций, железо,магний.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
