Диссертация (1151313), страница 55
Текст из файла (страница 55)
Повышение активности ЩФ259у кошек также наблюдали на частотах модуляции 20, 30 и 800 Гц, у собак — 800 Гц. Повышениеактивности ЛДГ у кошек снова наблюдали на частоте 800 Гц при тех же интенсивностях 0.4и 0.7 Вт/см2, у собак — 80 и 800 Гц при 0.4 Вт/см2, и наиболее выражено — на частотахмодуляции 400–600 Гц. У лошадей во всех вариантах опыта обнаружена стимуляция, самаязначительная при режимах обработки 0.05 Вт/см2, 100 Гц и 0.7 Вт/см2, 50 Гц.Понижение активности ферментов отмечали после обработки УЗ сыворотки крови:у кошек на частоте модуляции 20 Гц — АлАТ (интенсивностью 0.4 Вт/см2); 800 Гц — КК(интенсивностью 0.4 и 0.7 Вт/см2);у собак при 0.05 Вт/см2 на частоте модуляции 200 Гц и 0.7 Вт/см2 800 Гц — КК, ЛДГ при0.05 Вт/см2 на частоте модуляции 800 Гц и 0.2 Вт/см2 — 1000 Гц;у лошадей при интенсивности 0.4 Вт/см2 и частоте модуляции 10 Гц — КК; при 0.2 Вт/см2частоте 200 Гц и при 0.4 Вт/см2 частоте 80 Гц — АлАТ.
При 0.7 Вт/см2, частоте модуляции100 Гц — АсАТ. Активность ЛДГ не понижалось.Повышение активности ферментов плазмы крови отмечали после обработки режимами.У кошек: 0.05 Вт/см2 при частотах модуляции 70–80 Гц и 800 Гц, 0.4–0.7 Вт/см2 800 Гц — АлАТ;0.05 и 0.4 Вт/см2 при 800 Гц — АсАТ; 0.4 и 0.7 Вт/см2 при 800 Гц, а также 0.05 Вт/см2 при 70–80 Гц — КК; 0.05 Вт/см2 частота 800 Гц — ЩФ; 0.05 и 0.7 Вт/см2 при 800 Гц — ЛДГ.У собак: 0.4 Вт/см2 модуляция 800–900 Гц — АлАТ, тот же режим для АсАТ; 0.2 и 0.7 Вт/см2 10–20 Гц; также 0.4 Вт/см2 30–40 Гц — КК; 0.05 Вт/см2 800 Гц (max), 0.4 Вт/см2 800–900 Гц — ЩФ;0.2 Вт/см2 10–20 Гц, 0.05 Вт/см2 800 Гц, 0.4 Вт/см2 40 Гц и 0.7 Вт/см2 10–20 Гц, 50 Гц — ЛДГ.У лошадей: 0.2 Вт/см2 10, 20 и 200 Гц; 0.05 Вт/см2 200 Гц — АлАТ; 1.0 Вт/см2 800 Гц — АсАТ;0.2 Вт/см2 10 Гц, 0.4 Вт/см2 и 0.7 Вт/см2 800 Гц — КК; ЛДГ — 0.4 Вт/см2 800 Гц, 0.7 Вт/см2 10и 800 Гц.Режимы понижения активности ферментов плазмы крови.Кошки: ЛДГ, АсАТ и ЩФ не регистрировали; АлАТ и КК — при интенсивности УЗ 0.4 Вт/см2на частоте модуляции 30 Гц (АлАТ в 5раз и более), 0.7 Вт/см2 частоты из спектра10–20 Гц.Собаки: 0.4 Вт/см2 30 Гц небольшая супрессия АсАТ, больше трансферазы не угнетались;0.05 Вт/см2 800 Гц — КК — почти в 10 раз; 0.7 Вт/см2 800 Гц — ЩФ в 3 раза; 0.4 Вт/см2 30 Гц,0.7 Вт/см2 800 Гц — ЛДГ (в 1.5–2 раза).Лошади: 0.05 Вт/см2 10 Гц и 500 Гц, 0.4 Вт/см2 и 1.0 Вт/см2 10–20 Гц уменьшение активностиАлАТ в 4–8 раз; 1.0 Вт/см2 20 Гц — АсАТ (в 8–9 раз); 0.4 Вт/см2 20 Гц — КК в 3 раза;0.7 Вт/см2 100 Гц — ЛДГ.260Проведённый факториальный и дисперсионный анализ не выявил общих диапазоновактивных частот, при которых происходило бы влияние строго в заданном направлении —только активация или только торможение — на все исследованные ферменты у всех животныхи в сыворотке, и в плазме крови одновременно.
Но был определён режим воздействия,одновременно повышающий активность ЛДГ, АсАТ, ЩФ, АлАТ и КК плазмы крови МДЖ:интенсивность 0.4 Вт/см2, частота модуляции 800 Гц. Для плазмы крови лошадей параметрыобработки,инициирующиеувеличениеферментативнойактивности —интенсивность0.2 Вт/см2, частота модуляции 10 Гц.Уменьшение активности АлАТ сыворотки крови МДЖ вызывает аплитудномодулированный УЗ частотой 20 Гц, но с разной интенсивностью: у кошек — 0.4 Вт/см2, усобак — 0.7 Вт/см2.Подводя итог ферментного анализа, можно заключить, что все полученные результаты, втом числе одновременное ингибирование одних ферментов и активация других при действиианалогичных акустических параметров полностью согласуется с результатами авторов,доказавших [91, 92, 124, 205, 367], что изменение ферментативной активности происходит вовсех случаях реализации механизма биохимической адаптации. В нашем случае можно говоритьо клеточной или тканевой адаптации.
Полученные нами данные подтверждают гипотезузависимости активности ферментных систем от степени влияния различных фактороввнутренней и внешней среды клетки: любые воздействия на белок, приводящие к нарушению егоконформации, сопровождаются частичной или полной утратой белком его биологических ифизико-химических свойств в организме [90], поэтому инсонация непрерывным и амплитудномодулированным УЗ изменяла проницаемость ЦПМ, приводила к модификации молекул, в томчисле специфических ингибиторов или активаторов ферментов сыворотки и плазмы крови.26118. Получение интерферона после применения амплитудномодулированного ультразвука§ 18.1.
Влияние модулированного ультразвука на синтез интерферонаНа способ получения ИФН с помощью воздействия непрерывного УЗ терапевтическогодиапазона интенсивностей нами было получено авторское свидетельство СССР [2; рисунок 115в Приложении Б1 на странице 321]. Оптимальной признана трёхминутная обработка синтенсивностью до 0.2 Вт/см2 (рисунок 106). Удавалось выделить до 30% дополнительногопрепарата с помощью стоячей непрерывной акустической волны, а также стимулировать синтезИФН путём инсонации лейкомассы [230].Активность ИФН3000250020001500опыт1000контроль50000.05 0.10.20.40.712Интенсивность УЗ, Вт/см²Рисунок 106. Влияние 3-минутной обработки непрерывным УЗ различной интенсивности на продукцию (титр)ИФН «отработанными» лейкоцитами. Контроль — продукция ИФН интактными клетками.УЗ воздействие выбранной интенсивностью 0.05 Вт/см2 с амплитудной модуляцией800 Гц в течение 30–75 с стимулировало выход ИФН, его активность (p < 0.05) возрастала. Нарисунке 107 приведена зависимость продукции ИФН от длительности УЗ воздействия припостоянныхзначенияхчастотымодуляциии интенсивности.Наиболееоптимальнойэкспозицией можно считать время воздействия от 30 с до 60 с: активность полученногопрепарата была максимальной (2100–2900 МЕ).
Стимулирующий эффект начинался несколькораньше — после инсонации лейкоцитов 15 с. Затем увеличивался, доводя активность ИФН до2900 МЕ, а после 50 с экспоненциально уменьшался. Увеличение времени УЗ обработки более1.5 мин приводило к резкому снижению активности ИФН. Вышеизложенное позволило сделатьвывод, что при применении модулированного УЗ для обработки суспензии в процессебиосинтеза ИФН «отработанными» лейкоцитами оптимальной можно считать интенсивность0.05 Вт/см2, частоту модуляции 800 Гц и время экспозиции 30 с — 1 мин. В результате удалосьполучить дополнительно до 20–28% ИФН и более эффективно использовать донорскую кровь.262После верификации двух разных методик в Институте медико-биологических проблем РАН в2013–2014 годах можно заключить, что более 30% препарата в процессе суспензионногобиосинтеза ИФН из клеток не выходит.
Проведённые нами опыты с актиномицином D [8; 9]показали, что после инсонации из клеток выходит дополнительное количество ранеесинтезированного препарата, не извлекаемое оттуда традиционным способом [111].Титр ИФН, МЕ×10³3.532.521.5опыт1контроль0.50153045607590Время инсонации, сРисунок 107. Зависимость выхода интерферона-II от времени УЗ воздействия.
Интенсивность 0.05 Вт/см2, частотамодуляции 800 Гц.§ 18.2. Оценка интерферона. Реакция люминесцирующих бактерий наинтерферон различной концентрации (активности)Для проверки чистоты полученного ИФН, очищенного согласно разработанной схеме,использовали ELISA — тест на возможное присутствие в препарате иммуноглобулина IgG. Былоустановлено, что ИФН не содержал примесей иммуноглобулинов. Исходя из данных DS-Naэлектрофореза с необходимыми маркерами, была установлена молекулярная масса очищенноголейкинферона, равна: 20500 Дальтон.
В качестве дополнительного контроля чистоты ИФНприменили биосенсорную модель — Aliivibrio fischeri. Влияние ИФН показано на гистограммена рисунке 108. Ни одна из используемых доз препарата не влияла отрицательно на рости биохемилюминесценцию фотобактерий. Было показано, что культуру A. fischeri можноиспользовать и при экспресс-контроле с целью определения токсичности синтезированногоинтерферона. В этих экспериментах изучали реакцию бактерии на внесение интерферонаразличной активности (концентрации) от 125 до 1250 ME. Исследовали изменение показателяоптической плотности и интенсивности люминесценции сразу после внесения препарата, а такжев динамике роста культуры. С увеличением концентрации ИФН в среде интенсивность свеченияувеличивалась.
На скорость роста бактерий ИФН влияния практически не оказал. Следовательно,было показано отсутствие токсичности у полученного препарата ИФН.26380%70%60%50%40%30%20%10%0%Оптическая плотность43.532.521.510.50=К=К1252501250Активность ИФН, МЕОптическая плотность, отн. ед.Интенсивность свечения,+% к контрольному значениюИнтенсивность свеченияРисунок 108. Хемилюминесценция A. fischeri в присутствии ИФН.Таким образом, можно заключить, что культура A. fischeri быстро и определённымобразом реагирует на присутствие внешних факторов, поэтому применение подобной тестсистемы в качестве биосенсора вполне оправдано и перспективно.
Люминесцирующие бактериилегко культивируются; из них можно получить большое количество люциферазы — до 5% отмассы клеток, люциферин-люциферазные комплексы, в том числе иммобилизованные наносителях, и использовать в биотестировании.Итак, опробовано воздействие модулированного УЗ на процесс синтеза лейкоцитарногоинтерферона.
Найден эффективный режим акустической обработки: интенсивность 0.05 Вт/см2,частота модуляции 800 Гц и время экспозиции 30 с — 1 мин. Стимулирующий эффектнаблюдается при временно́й экспозиции 15 с — 1.5 мин. Облучение однократно использованныхклеток стоячей непрерывной и бегущей амплитудно-модулированной УЗ волной даётвозможность получать до 30% препарата дополнительно.26419. Действие ультразвука на ткани лабораторных животныхin vivo§ 19.1. Количественный анализ действия модулированного ультразвука насперматозоиды мышей in vivoРезультаты воздействия УЗ с различной частотой модуляции (10, 250, 520, 1000 Гц)и непрерывного на сперматогенные клетки семенников мышей в течение 5 минут представленыв таблице 40 на странице 160 и рисунках 109–112.
Из таблицы видно, что УЗ воздействие насеменники мышей вызывало достоверное (p < 0.05) уменьшение числа первичных покоящихсясперматоцитов и пахитенных сперматоцитов при всех исследованных частотах модуляции УЗ,кроме частоты 250 Гц. Анализ диаграмм вскрывает, что при воздействии непрерывного УЗ насеменники мышей изменения числа первичных покоящихся сперматоцитов достигало 13%(рисунок 109), число пахитенных сперматоцитов снизилось на 16% по сравнению с контролем(рисунок 110).Покоящиеся первичные сперматоцитыПроцент жизнеспособныхПокоящиесяпервичныесперматоцитыНепрерывныйКонтроль10Гц250Гц520Гц1000ГцРисунок 109.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
