Автореферат (1150550), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Такие пептиды могутформировать ковалентную связь с распознаваемой мишенью и приводить к точечномувоздействию на клеточные механизмы, тем самым приводя клетку к гибели. Ряд подобныхпептидовбылразработанвлабораторииБиомолекулярногоЯМРСПбГУ.Онипродемонстрировали возможность успешного уничтожения раковых клеток (результатыопубликованы в работе [15]).Разносторонняя характеризация систем, подобных изученному домену RRM2 из белкаTDP-43, является существенным вкладом в понимание нейропатологических процессов,вызванных окислительным стрессом.Анализ спиновой релаксации ядер15N в нативно разупорядоченном белке показал, что всовременной литературе представлено неполное описание мод движения, отвечающих за ЯМРрелаксацию. Новые данные, полученные из совместной интерпретации данных ЯМРрелаксации и МД, позволили внести ясность в данный вопрос.6Основные положения, выносимые на защиту1.
Сочетание метода ЯМР релаксации с квантово-химическими расчетами позволяетопределять времена корреляции вращательного движения молекул воды в гидратномокруженииотдельныхфункциональныхгруппорганическихмолекулсбольшейдостоверностью. В частности, было установлено: (i) времена корреляции вращательногодвижения молекул воды вблизи гидрофобной метиленовой группы в 1,5-2 раза длиннее, чем уобъемной воды, в температурном диапазоне от 2 до 75˚C; (ii) времена корреляциивращательного движения молекул воды в гидратных оболочках гидрофильных групп немногодлиннее, чем в объемной воде при температурах выше 60°C, но при более низких температурахони составляют 0,8 ÷ 1,0 от значений времени корреляции для объемной воды.2. Разработанный новый ЯМР-эксперимент на базе 1H,15N HSQC позволяет определятьскорости H/D обмена в агрегатных частицах белков, формирующихся при окислительномстрессе.
Данные по H/D обмену, наблюдаемому с помощью этого метода на изотопно-меченныхобразцах белка RRM2 показывают, что (i) дисульфид-связанные димеры могут служитьзародышем агрегации белков, (ii) формируемые агрегатные частицы включают в себя не толькоразвернутые димеры и олигомеры, но и развернутые мономеры, (iii) между фракциейрастворимых мономеров и агрегированным белком происходит обмен за счет обменнойреакции тиол-дисульфид.3. На основе данных ЯМР по H/D обмену и рефолдингу, а также результатовкомпьютерного моделирования МД установлено, что дисульфид-связанные агрегаты (димеры иолигомеры) перешедшие в развернутое состояние под действием большой тепловойфлуктуации, обладают низкой способностью к рефолдингу.
Это приводит к постепенномупереходу белка от нативного состояния к разупорядоченному.4. Разработанная новая методика, основанная на совместном анализе данных измеренийдиффузии с помощью ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля и динамическогорассеяния света, позволяет определить функции распределения белковых агрегатных частиц поразмерам. В частности, на примере домена RRM2 белка TDP-43 показано, что размерыагрегатных частиц распределены по экспоненциальному закону.5.
Новый подход, заключающийся в том, что экспериментальные скорости релаксации ЯМРанализировались совместно с предсказанными МД скоростями, позволил извлечь сведения обосновных модах движения, обуславливающих ЯМР релаксацию для атомов в основной цепинативно разупорядоченных белков.7Личный вклад автораПостановка целей и задач диссертации была осуществлена совместно автором и научнымруководителем – Н.Р. Скрынниковым.
Разработка протоколов экспериментов, выполнениеэкспериментов, численные расчеты, обработка данных и большая часть компьютерногомоделирования выполнены лично автором. Моделирование МД, описанное в главе 3,выполнено К. Кемпф. Основные результаты и выводы диссертации сформулированы личноавтором. Публикации, лежащие в основе глав 1 и 2 диссертации, написаны автором,публикации, лежащие в основе главы 3, написаны в соавторстве с К. Кемпф.
В подавляющембольшинстве выступлений на конференциях по теме диссертации автор был основнымдокладчиком.Апробация и достоверность работыДостоверность работы обеспечена использованием ряда независимых апробированныхметодов исследования биологических молекул для валидации результатов. Эти методы, какрасчетные, так и экспериментальные, базируются на различных физических принципах,поэтому согласованность и воспроизводимость их результатов делает выводы диссертациинадежно обоснованными.По материалам диссертации автором сделаны доклады на следующих конференциях.1.The 42nd FEBS Congress “From molecules to cells and back”, Иерусалим, Израиль, 2017.2.10th, 11th, 12th, 13th, and 14th Winter Youth School-Conference «Magnetic Resonance and ItsApplications», Санкт-Петербург, 2013-2017.3.Актуальные проблемы трансляционной биомедицины, Санкт-Петербург, 2017.4.XXXVIII Finnish NMR symposium, Ювяскюля, Финляндия, 2016.5.60th Biophysical Society Meeting, Лос-Анджелес, США, 2016.6.International Student Conference «Science and Progress-2016», Санкт-Петербург, 2016.7.Всероссийская конференция с международным участием «Окислительный стресс впсихиатрии и неврологии», Санкт-Петербург, 2016.8.XII International Workshop on Magnetic Resonance (Spectroscopy, Tomography and Ecology),Ростов-на-Дону, 2015.9.EMBO Practical Course 2014: Multidimensional NMR in Structural Biology, Берлин,Германия, 2014.10.
International Symposium and Summer School in Saint Petersburg, Nuclear Magnetic Resonancein Condensed Matter, 11th meeting: «Biomolecular NMR and related phenomena», СанктПетербург, 2014.811. Молодежная конференция-школа «Физико-химические методы анализа в органическойхимии», Санкт-Петербург, 2013.12. International Symposium and Summer School in Saint Petersburg, Nuclear Magnetic Resonancein Condensed Matter, 10th meeting: «NMR in Life Sciences», Санкт-Петербург, 2013.13.
EUROMAR 2013, Херсониссос, Греция, 2013.14. XV International Youth Scientific School «Actual problems of magnetic resonance and itsapplication», Казань, 2012.Структура работыДиссертация состоит из введения, трех глав и заключения. Работа изложена на 134страницах и включает 35 рисунков и 2 таблицы. Библиографический список содержит 175наименований.СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИВо введении описаны актуальность, новизна и практическая ценность диссертации,поставлена цель и задачи, сформулированы основные положения, выносимые на защиту,приводится информация о личном вкладе автора в проделанную работу, о достоверности иапробации результатов на семинарах и конференциях, о публикациях по теме работы, а также оструктуре диссертации.В последующих трех главах предлагаются новые подходы и методики ЯМР, а такжеобсуждаются результаты их применения к биологическим молекулярным системам, которыетрудно изучать современными биофизическими методами.В первой главе в начале дается краткий обзор состояния проблемы гидратацииорганических молекул.
Далее даны детали теории ЯМР релаксации для систем с быстрымобменом, описание пробоподготовки и проведенных экспериментальных измерений. Затемрассматривается проблема разработки новых подходов для исследования гидратацииамфифильных молекул с использованием данных ЯМР релаксации ядер растворителя иквантово-химических расчетов. Молекулы воды в гидратных оболочках гидрофобных игидрофильных групп обладают различными структурными и динамическими свойствами, чтоявным образом отражается в измеряемых скоростях ЯМР релаксации ядер растворителя врастворах. Для обменивающихся подструктур растворителя эти скорости 1 задаютсяследующим выражением1 = ∑ 19(1)Здесь и 1 – относительная концентрация и скорость спин-решеточной релаксации для -йподструктуры, соответственно.
Для исследованных водных растворов ω-аминокислот в D2Oвыделяются гидратные оболочки групп NH3+, COO- и CH2, а также подструктура свободногорастворителя. В качестве примера, который может использоваться в контексте белковойбиофизики, в работе изучаются скорости релаксации для растворов глицина (GLY), β-аланина(bALA), γ-аминомасляной кислоты (GABA) и ε-аминокапроновой кислоты (6ACA) в D2O (см.2Рис. 1). При рассмотрении скоростей ЯМР релаксацииH для образцов аминокислот,содержащих различные комбинации молекулярных групп, представляется возможнымсоставитьрелаксации2°Cуравнениядлядля1вычисленияядерскоростейдейтериявблизигидрофобной группы CH2 и гидрофильных NH3+ иCOO- из измеряемых скоростей 1 .Расчеты 1 требуют значений координационныхчисел для отдельных молекулярных групп.
Они былиопределеныспомощьюквантово-химическихрасчетов с высоким уровнем теории (B3LYP/631++G(d,p))25°Cдлякластеров[GLY + 60 H2O]Полученные[bALA + 70 H2O].изначениякоординационных чисел (2 = 7, 3 = 3, =4) согласуются со значениями, оцененными изконцентрационныхзависимостей1пометодуописанному в работе В.И. Чижика [16].Такимобразом,удалосьполучитькоординационные числа для молекулярных групп, а55°Cтакже с их помощью – относительные временапереориентации молекул D2O в гидратных оболочкахсоответствующих групп ( = /0, и 0 – времякорреляциивращательногодвижениядля-йподструктуры и объемной воды, соответственно; см.Таблица 1).
Для полученных скоростей релаксацииРисунок 1. Концентрационные зависимостиизучались температурные зависимости (см. Рис. 2),1 дейтронов в водных растворах GLY (1,которые раскрыли новые особенности гидрофобногочерный),bALA(2,синий),GABA(3,красный) и 6ACA (4, зеленый) при 2°C (a),25°C (b) и 55°C (с).эффекта.Временакорреляциивращательногодвижения D2O в гидратной оболочке метиленовой10группы аминокислот в 1,5 ÷ 2 разадлиннее, чем для чистой D2O при T от2до75°C.ВременавращательногокорреляциидвижениявD2Oгидратных оболочках гидрофильныхгруппнемногодлиннее,чемвобъемной воде при T > 60°C, исоставляют 0.8-1 от значений дляобъемной воды при T < 60°C.ВглавыРисунок 2. Температурные зависимости скоростей релаксациирассматривается влияние медленногодейтронов воды в чистой D2O (сплошная черная линия), вобмена аммонийных атомов водородагидратных оболочках метиленовой группы (1, синий) и всконцепервойрастворителемнарезультатыпредложенного в работе подхода игидратной оболочке карбоксильной и аммонийной групп (2,красный).доказывается незначительность этого вклада в наблюдаемые скорости ЯМР релаксации.Во второй главе вначале дается описание состоянияпроблемыразупорядочиванияиагрегациибелковприокислительно-восстановительных процессах.
Затем приводятсядетали пробоподготовки и экспериментальных измерений. Приэтом внимание уделено получению ЯМР спектров 1H,15N HSQC,Таблица 1. Относительное времякорреляциидвижениявращательногомолекулводывгидратной оболочке CH2 (2 ) ив гидратных оболочках COO- иNH3+ ( ).отнесению сигналов, ЯМР релаксации, H/D обмену, ЯМРдиффузометрии, динамическому рассеянию света (ДРС), гель-2˚C25˚C55˚Cэлектрофорезу, протеолизу, сайт-направленному мутагенезу и22,01,81,6микросекундному моделированию МД.0,80,91,0С помощью спектроскопии 1H,15N HSQC, а также измеренийЯМР релаксации и других вспомогательных биофизических методов показано, что вокислительныхусловияхRRM2образуетдисульфид-связанныеразворачиваются, а затем собираются в агрегатные частицы (AЧ).11димеры,которыеРисунок 3. Данные H/D обмена дляобразцаподвергнутогоRRM2,окислениюспоследующимвосстановлением:объемыспектрального пика остатка F231 всерии последовательно записанныхспектров HSQC .
(A) Контрольный(неокисленный) образец, 100% H2Oбуферный раствор. (B) Контрольный(неокисленный) образец, 80% D2O /20% H2O буферный раствор. (C)Окисленныйобразец,100%H2Oбуферный раствор. (D) Окисленныйобразец , 80% D2O / 20% H2Oбуферныйраствор.Окислениеобразца заключалось в обработке5 мМ H2O2 в течении 2 ч, от t = 55мин до t = 2 ч 55 мин, и прерывалосьобработкой25мМДТТ.(Е)Отношенияобъемовпиковотобразцоввдейтерированномпротонированном2/2 =Коэффициентымеройбуферах, =(черные2/2исимволы)и(зеленые символы). и служатнасыщениядейтериемвсоответствующих образцах.Классический эксперимент по H/D обмену не работает в системе, где постепенноформируются АЧ, потому что распад сигнала ЯМР обусловлен сразу двумя факторами: (1)переход белка в АЧ и (2) собственно H/D обмен.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
