Автореферат (1150550), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Кроме того, переход белка в АЧ происходитбыстрее, чем H/D обмен, поэтому эксперимент становится малочувствительным к самомуобмену. Нам пришлось создать новый эксперимент, где мы наблюдаем за сигналами впротонированном и дейтерированном буферах, чтобы разделить вклады (1) и (2), а такжеподвергаем образец окислению с последующим восстановлением, чтобы вернуть белок вглобулярную форму и восстановить интенсивность сигналов ЯМР. Степень насыщениядейтерием амидных групп в агрегатных частицах определяется по интенсивности сигналов12ЯМР в спектрах 1H,15N BEST- HSQC [17] после того, как образец подвергается окислениюперекисью водорода в течении 2 ч, а затем восстановлению с помощью дитиотреитола. Примерданных такого эксперимента приведен на Рис. 3 для аминокислотного остатка F231 доменаRRM2 из белка TDP-43.Предложенный эксперимент вместе с рядом другихизмерений применяется для изучения АЧ RRM2.
Привосстановлении окисленного образца путем обработкивосстанавливающим агентом ДТТ обнаруживается, чтоосновная часть белка восстанавливается до глобулярногомономерного состояния, однако остаточная фракциячастиц на протяжении нескольких дней не проявляетпризнаковвосстановления.Установлено,чтоАЧпредставляет собой агломерацию пептидных цепей,связанныхкакнековалентнымидисульфиднымисвязями,взаимодействиями.Стакипомощьюобменного эксперимента было доказано, что пептидныецепи в АЧ сильно разупорядочены и неоднородны. Спомощью спектроскопии ЯМР и гель-электрофорезабыло показано, что при добавлении протеазы трипсин кконтрольномуобразцубелокостаетсяструктурноцелостным, в аналогичном эксперименте на окисленномобразценаблюдаетсябыстраяпротеолитическаядеградация RRM2. Также было доказано, что АЧ могутРисунок 4.захватывать/высвобождать мономерный RRM2 черезфункцииреакции обмена тиол-дисульфид.окисленного, и восстановленного образца(A) АвтокорреляционныеДРСдляконтрольного,(красные, синие и зеленые символы,Для того чтобы охарактеризовать распределение АЧсоответственно).
(B) Зависимость сигналаRRM2 по размеру и смоделировать соответствующуюЯМР от силы градиента , измереннаяфункцию распределения предлагается совместный анализдля глобулярного мономерного RRM2 вкоэффициентов диффузии полученных методом ЯМР симпульсным градиентом магнитного поля и методомконтрольном и восстановленном образцах(красныеизеленыесимволы,соответственно), а также для агрегатныхдинамического рассеяния света.
Интенсивность сигналовчастиц RRM2 в полностью окисленномЯМР зависит от радиуса АЧ , как 3 , при условииобразце (синие символы).независимости плотности АЧ от размера. В то же время,интенсивность рассеянного света пропорциональна 6 . Это означает, что метод динамического13рассеяния света более чувствителен к АЧ большего размера, а ЯМР диффузометрия наоборотболее чувствительна к меньшим частицам. На практике для обоих методов экспериментальныеданные (диффузионное затухание сигнала, формально многоэкспоненциальное) хорошоописываются одной экспоненциальной функцией, отражающей эффективное значение размераАЧ (см. Рис. 4).
Для АЧ RRM2 было показано, что измеренные коэффициенты диффузииразличаются: ЯМР = 0,55 ± 0,02 · 10-10 м2/с и ДРС = 0,40 ± 0,01 · 10-10 м2/с в соответствии свышеизложенными соображениями.ДлямоделированияраспределенияАЧпофункцииразмерамнеобходимо сделать следующие шаги. (i)Выбрать тип функции распределения изадатьначальныепараметрыфункции. (ii) Рассчитатьэтойданные длядиффузионных спадов ЯМР ( ) и ДРС ()как в эксперименте, исходя из выбранногонаРисунок 5.
Распределение размеров АЧ в окисленномобразцеRRM2:() = −1 exp(−( − )/),( ≥первомшагеиполучитьсредневзвешенные8,5 Å, = 28,6 Å. Желтые кривые отражают результатыдиффузии.указанными выше погрешностями.экспериментальныхкоэффициентов(iv)эффективныекоэффициентыСоставитьиминимизировать функционал, заданныйкакдиффузии(iii)Аппроксимировать диффузионные спады ), полученная путем оптимизации двух параметров: =моделирования методом Монте-Карло в соответствии сраспределения.отквадратичноемодельных.Такимотклонениеобразомнайтиоптимальные параметры функции распределения АЧ.
Описанный подход позволил определитьдля АЧ RRM2, что они в хорошем приближении описываются экспоненциальнымраспределением (см. Рис. 5).Совокупность данных по ЯМР H/D обмену, рефолдингу и компьютерному моделированиюМД позволила нам составить картину процессов, происходящих в системе RRM2 привоздействии окислительных соединений. Было показано, что сформированные вследствиеокисления дисульфид-связанные димеры RRM2 могут быть стабильны на коротких временах(единицы мкс), однако на более длинных временах (минуты) они оказываются уязвимы длятепловых флуктуаций, разворачиваются и образуют АЧ.
В восстановительных условияхдисульфидные связи разрушаются, происходит разрушение АЧ, рефолдинг белка и переход14равновесия обратно к мономерной глобулярной форме, хотя остается некоторая часть АЧ неподдающихся быстрому восстановлению.Втретьейрассмотренаглавединамиканативно разупорядоченныхбелков(IDP)васпектевлияния на процесс ЯМРрелаксации.Вначаледанкраткий обзор литературыпо вопросу различных типовдвижения в IDP, а также помоделированиюмолекулярной динамики дляIDPсразличнымимоделямиМДводы.Описываютсядеталипробоподготовки,ЯМРэкспериментовикомпьютерногомоделированияРисунок6.Сравнениеэкспериментальныхирасчетныхрелаксации для МД-моделирования с водой TIP4P-D в образцескоростей15N H4. (а)15Скорости ЯМР-релаксации N 1 , измеренные при 5°C, 25°C и 55°C.
(b) 1 ,рассчитанные из MD-моделирования. (c) Скорости ЯМР-релаксации 15N ,измеренные при 5°C, 25°C и 55°C. (d) , рассчитанные из MD-дляN-моделирования.концевого хвоста гистонаH4(25аминокислотныхостатков).ДалееприводятсяскоростиЯМРрелаксацииэкспериментально измеренные для образца H4, а также полученные с помощью моделированияМД (см. Рис. 6).
На основе сравнения данных эксперимента и моделирования при различныхтемпературах обосновывается выбор модели воды TIP4P-D.Можно выделить 4 типа молекулярного движения для IDP: (i) сверхбыстрые движения, (ii)колебания двугранных углов основной цепи белка φ и ψ, (iii) скачки двугранных углов φ и ψ и(iv) трансляционная и вращательная диффузия.
Для изоляции каждого типа движения исоотнесения с временами корреляции, полученными из анализа движения вектора NH амидныхгрупп IDP, проводится генерация модифицированных траекторий МД. В частности, дляудаления эффектов диффузии производится выравнивание белковой молекулы между кадрамиМД по атомам выбранной пептидной плоскости. Для разделения колебаний двугранных углов искачков двугранных углов исходная траектория обрабатывается таким образом, что всезначения двугранных углов устанавливаются на фиксированные значения в зависимости от15типа конформации. Тип определяется по принадлежности конформации (углы φ и ψ) копределенной области на карте Рамачандрана.
Такой подход к анализу траекторий позволяетвычленить вклады отдельных динамических процессов в ЯМР релаксацию. А именно втраектории МД с водой TIP4P-D выявлены моды движения, которые вносят наибольший вкладв ЯМР релаксацию15N: колебания двугранных углов основной цепи белка вызываютрелаксацию, как в гибкой (первые 15 аминокислот), так и в более структурированной части (Cконец) хвоста H4, однако для гибкой части существенный вклад составляют скачкообразныеизменения этих углов, чего не наблюдается для структурированной части.ЗАКЛЮЧЕНИЕДиссертация представляет развитие методов ЯМР в нескольких направлениях. Во-первых,предложен ряд новых подходов ЯМР спектроскопии для белков в агрегированном состоянии,позволяющих с помощью наблюдения спектров глобулярной формы белка сделать выводы остепени разупорядочивания пептидных цепей в агрегированном состоянии. Также предложенметод для определения параметров распределения частиц по размерам в полидисперснойсистеме агрегатных частиц.
Во-вторых, рассмотрение гидратной оболочки аминокислот каксуперпозиции гидратных оболочек отдельных молекулярных групп и квантово-химическиерасчетыводногоокружениясделаливозможнымопределениехарактерныхвременпереориентационного движения молекул воды в этих гидратных оболочках. В-третьих,измерения ЯМР релаксации15N в нативно разупорядоченных белках были интерпретированысовместно с данными моделирования МД, что позволило выявить основные модымолекулярного движения, ответственные за процесс ЯМР релаксации в подобных системах.Методы ЯМР, а также ряд других вспомогательных биофизических методов, былиприменены для изучения систем, включающих в себя аминокислоты и белки.
В каждой из трехрассмотренных систем было произведено всестороннее исследование свойств систем, чтопозволило достигнуть глубокого понимания процессов и физических явлений. В частности,можно привести следующие основные результаты и выводы.1. Обнаружено, что при низких концентрациях аминокислот в D2O скорости ЯМР релаксацииядер 2H воды зависят линейно от числа метиленовых групп в структуре аминокислоты.
Наоснове обнаруженной аддитивности вкладов в релаксацию ядер растворителя построенамодельводногоокруженияω-аминокислот.Квантово-химическиерасчетыиэкспериментальные данные ЯМР согласованно показывают, что гидратное окружениегруппы CH2 содержит 7 молекул воды. Времена корреляции вращательного движениямолекул воды вблизи гидрофобной метиленовой группы в 1,5-2 раза длиннее, чем у16объемной воды, в температурном диапазоне от 2 до 75˚C. Времена корреляциивращательного движения молекул воды в гидратных оболочках гидрофильных группнемного длиннее, чем в объемной воде при температурах выше 60°C, но при более низкихтемпературах они составляют 0,8 ÷ 1,0 от значений времени корреляции для объемнойводы.2.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
