Автореферат (1150377), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Перерастворение сорбента в неполярных растворителях с последующей жидкость-жидкостной экстракцией фосфорилированных пептидов водой позволяет значительно улучшить извлечение аддуктов из образца.Добавление ПФОСК как еще более сильного донорного соединения к элюентупозволяет повысить степень десорбции.
Были опробованы три методики десорбциис добавлением ПФОСК к элюенту (рис 12), каждая методика проверялась перерастворением сорбента и с целью определения степени десорбции. Лучший результатбыл получен при обработке сорбента раствором пиперидина с добавкой ПФОСК(рис. 13)Рисунок 12. Схема оптимизации десорбции аддуктов зомана с сывороточнымальбумином человека с монослоев стеарата лантана.16Рисунок 13. – Масс-спектры элюатов с монослоевстеарата лантана, полученных по схеме III: 1 – 0,5%водный пиперидин с0.015% добавкой ПФОСК,2 – 70% водный ацетонитрил с 0.015% добавкойПФОСК в 0,1% ТФУ послеперерастворения сорбентав гексанеКроме того, на образце, содержащем пептиды сывороточного альбумина человека, модифицированного зоманом, показана возможность обогащения фосфорилированных пептидов непосредственно на МАЛДИ мишени, что позволяет идентифицировать пептиды без проведения десорбции.Также было проведено исследование возможности выделения методомметалл-аффинной хроматографии аддуктов бутирилхолинэстеразы лошади сФОВ.
В отличие от бычьего казеина, бутирилхолинэстераза лошади не содержит в своем составе фосфора и ее активный центр находится в кармане макромолекулы. Методом АСМ показано, чтобутирилхолинэстераза лошади в нативной форме успешно сорбируется и десорбируется с монослоев стеарата лантана, в то время, как после обработкиRVx десорбции в растворе аммиака непроисходит (рис.
14).Контрольное исследование сорбциРисунок 14. Исследование взаимодейонной способности по отношению к буствия бутирилхолинэстеразы лошади смонослоями стеарата лантана методом тирилхолинэстеразе лошади модифицированной ФОВ проводилось с помощьюАСМ: а, б - бутирилхолинэстераза лоМАЛДИ-МС-МС. Триптический гидрошади (50х50мкм), в, г - бутирилхолизат бутирилхолинэстеразы, инкубиролинэстераза лошади, модифицированная RVx (50х50мкм), а, в – после сорб- ванной с зоманом, разбавленным в 10ции в 0,1% ТФУ, б, г – после десорбции раз по сравнению с предыдущими экспев 5% аммиаке.риментами, сорбировали на коллапсированные монослои стеарата лантана вспиновой колонке, затем исследовали проскок и элюат на предмет наличия сигналов,соответствующих фосфорилированным пептидам.
Методом тандемной масс-спектроскопии показано, что сигнал, присутствующий в элюате соответствует аддукту сзоманом и его состарившейся форме – аддукту с метилфосфоновой кислотой (рис1715). На масс-спектрах хорошо виден сигнал при 2277 Да, соответствующий состарившейся форме – аддукту пептида с метилфосфоновой кислотой, аддукт с зоманомпроявляется только при элюировании ацетонитрилом с ТФУ.
Был сделан вывод, чтосорбент обладает большим сродством к несостарившейся форме, чем к состарившейся.Рисунок 15. МАЛДИ-массспектры элюатов с монослоев стеарата лантанатриптического гидролизатабутирилхолинэстеразы лошади, модифицированнойзоманом. 1 – проскок с колонки; 2 – 0,5% водный пиперидин; 3 – 70% водныйацетонитрил с 0,1% ТФУ.Выводы1. Получены и охарактеризованы мономолекулярные пленки на основе стеараталантана. Показана возможность использования в качестве сорбентов как перенесенных на твердую подложку монослоев стеарата лантана, так и коллапсированных монослоев.2. Золь-гель методом с применением микроволнового излучения синтезировандисперсный хромит лантана.
Определена структура агрегатов, размер частиц. Показана принципиальная применимость в качестве металл-аффинного сорбента.3. Изучена структура поверхности хромита лантана и коллапсированных монослоев на основе стеарата лантана методами сканирующей электронной микроскопии.
Определена удельная поверхность сорбентов: 15,5 м2/г для хромита лантана, 14м2/г для коллапсированных монослоёв на основе стеарата лантана.4. Оптимизированы условия сорбции и десорбции фосфорилированных пептидов коллапсированными монослоями на основе стеарата лантана.5. Определена сорбционная ёмкость коллапсированных монослоев на основестеарата лантана по пептиду SSNGHV(pY)EKLSSI (20 мкг/мг).6. Доказана пригодность коллапсированных монослоев на основе стеарата лантана для использования в качестве селективного металл-аффинного сорбента дляфосфорилированных пептидов.
Показана возможность выделения фосфорилированных и фосфонилированных пептидов из пептического гидролизата альбумина человека.7. Доказана возможность селективного выделения аддуктов зомана с пептидамисывороточного альбумина человека на коллапсированных монослоях на основе стеарата лантана.8. Доказана возможность выделения аддуктов полноразмерной бутирилхолинэстеразы с RVx на коллапсированных монослоях на основе стеарата лантана.18Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:Статьи, опубликованные в журналах, рекомендованных ВАК:1. В.В. Шиловских, П.В. Качанов, Н.Г. Суходолов. Микроволновый синтез хромиталантана. // Вестник СПбГУ, серия 4 физика, химия, том 3 №1, 2016 cтр.
120-124.2. Е. В. Шрейнер, О. А. Кельциева, В. Э. Шустов, Н. Г. Суходолов, В. В. Шиловских, А.Ю. Ширкин, М. Л. Александрова, З. А. Жаковская, Е. П. Подольская. Разработка металл-хелатного сорбента на основе стеарата никеля (II). // Научное приборостроение,2015, том 25, № 4, c. 19–243. Fedorova A.V., Chezhina N.V., Shilovskikh V.V.
State of atoms and interatomic interactions in perovskite-like oxides: XXXIV. State of europium atoms and exchange interactions in La(1-y)EuyAlO3. // Russian Journal of General Chemistry. 2015. Т. 85. № 10. С.2223-2226Другие публикации по теме диссертации4. Andrey A. Mitrofanov, Elena S. Silyavka, Vladimir V. Shilovskikh, Petr D. Kolonitckii,Nikolai G. Sukhodolov and Artem A. Selyutin. Microwave synthesis of nanostructuredoxide sorbents doped with lanthanides. // STRANN 2016 AIP Conf.
Proc. 1748, 0400071–040007-5.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
