Автореферат (1150377), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Для ПЛБ на основе стеарата0лантана масса одного квадратного деци23456метра пленки составляет 0.029 ± 0.003мг.-10-20pHРисунок 4. Зависимость ∆А2,5 от рНводной субфазы, содержащей 10-4 Мхлорид лантана.Определение электрокинетического потенциалаОдним из параметров, характеризующих свойства поверхности, являетсяэлектрокинетический потенциал (ζ-потенциал). С целью определения области рН в которой поверхность полученной1020100-100246810-20-30Рисунок 5.
Зависимость электрокинетического потенциала монослоев стеарата лантана от рН раствора.структуры заряжена положительно, чтоспособствует лучшей сорбции, была измерена электрофоретическая подвижность и определена изоэлектрическаяточка для коллапсированных монослоевстеарата лантана (ИЗТ=3.5). На основеизмеренной электрофоретической подвижности были рассчитаны значенияэлектрокинетического потенциала (рис.5).
Электрокинетический потенциал рассчитывался по формуле ГельмгольцаСмолуховского без введения дополни-тельных поправок.Определение устойчивости сорбента к различным растворителямУстойчивость образца к воздействиюразличныхрастворителей – важная хаΔm=(mнач–mкон)/mнач*100 рактеристика потенциального сорбента.РастворительВысокая устойчивость открывает воз%можности использования сорбента в бо0,1 % ТФУ0,0лее жестких условиях, упрощает работу свеществом. Потому была проверена0,1 % HCOOH2,7устойчивость к растворению в различных2 % уксусная кислота1,7растворителях, традиционно встречающихся в хроматографии (таблица 1).5 % аммиак5,0В первую очередь сорбент должен0,5 % пиперидин7,1быть устойчив к жидким носителям ана0,5 % триэтиламин6,8лита.
К ним относятся растворители, используемые на стадии сорбции и про100 % ацетонитрил11,0мывки: 0,1 % водный раствор трифторук100 % метанол3,6сусной кислоты, 0,1 % водный раствормуравьиной кислоты, 2 % водный рас100 % этанол2,5твор уксусной кислоты. Также жела100 % изопропанол5,0тельно, чтобы сорбент не растворялся0,015 % ПФОСК в 0,5при десорбции, и его можно было бы ис4,0% пиперидинепользовать повторно. Растворители, используемые на стадии десорбции: 5 %Тетрахлорметан45,0водный раствор аммиака, 0,5 % водныйГексан55,0раствор пиперидина, 0,5 % водный раствор триэтиламина, 100 % ацетонитрил,37 % НCl48,0100 % метанол, 100 % этанол, 0,5 % вод50 % H2SO454,0ный раствор пиперидина с добавкой перфтороктановойсульфокислотыТаблица 1 Устойчивость монослоев (ПФОСК).
Были проверены и раствористеарата лантана в различных растели, применение которых не предполатворителях.гается. Эти растворители разрушают сорбент: тетрахлорметан, гексан, минераль-11ные кислоты. Данные эксперимента показали, что разбавленные муравьиная и уксусная кислота практически не растворяют стеарат лантана (изменение массы составило 0 ± 3 %) и могут быть использованы без серьезных ограничений. При обработкесорбента разбавленными аммиаком, пиперидином, триэтиламином, ПФОСК концентрированными метанолом, этанолом, изопропанолом изменение массы сорбентасоставило 5 ± 3%, что также позволяет использовать эти растворители с аккуратностью. При обработке сорбента чистым ацетонитрилом изменение массы составилооколо 10 %, соответственно, возможно его использования только при малой экспозиции.
При обработке тетрахлорметаном, гексаном, 50% серной кислотой и концентрированной соляной кислотой изменение массы оказалось очень значительным, использование этих растворителей при работе со стеаратом лантана крайне нежелательно.Сканирующая электронная микроскопия коллапсированных монослоев на основе стеарата лантанаСтруктура коллапсированных ПЛБ исследовалась методом сканирующей электронной микроскопии. Коллапсированные монослои переносились на поверхностькремниевой подложки, излишки влаги удалялись безворсовыми салфетками.Рисунок 6. Микрофотографии коллапсированных слоев стеарата лантана; а –фрагменты коллапсированных МС, SE; б – складчатая структура коллапсированных МС, SE; коллапсированные МС на монокристаллическом кремнии, BSE; фрагмент коллапсированных МС при большом увеличении, SE.12На микрофотографиях во вторичных электронах (SE) хорошо видны участкимеханического разлома пленок (рис. 6, а), и складчатость, полученная при коллапсепленки (рис.
6, б), в режиме обратнорассеянных электронов (BSE) видно, что монослой однороден по составу (рис. 6, в). При большем увеличении видно наличиефрагментов пленки с поверхностью, доступной для сорбции (рис. 6, г).Сделано предположение, что в присутствии полярных растворителей монослоимогут расправляться и увеличивать эффективную поверхность, доступную для сорбции. Коллапсированные монослои на подложке обрабатывали ацетонитрилом и, длясравнения, гексаном. На изображении 7 представлены результаты длительной обработки. Гексан практически не изменяет структуру поверхности (рис 7, а), участки“рваных краёв” сохраняются (рис 7, г), монослой не изменяется.
В случае обработкиацетонитрилом края монослоев оплывают (рис 7, б), на поверхности подложки возникают легкоплавкие структуры значительной толщины (рис 7, г), следовательно,можно сделать вывод, что неполярные растворители практически не влияют наструктуру, полярные при длительной обработке приводят к её разрушению.Рисунок 7. Микрофотографии коллапсированных слоев стеарата лантана послеобработки: а, в – гексан, б, г – SE, ацетонитрил.Исследование возможности использования сорбентов, содержащих ионылантана для металл-аффинной сорбцииИсследование сорбционной способности методом МАЛДИ-МС проводилось напептическом гидролизате сывороточного альбумина человека, модифицированногозоманом. Как показано на рисунке 8, сигналы фосфорилированных пептидов при-13сутствующие в масс-спектре образца отсутствуют или имеют меньшую интенсивность в сигнале проскока.
Таким образом, монослойный дистеарат лантана вполнеможет использоваться как металл-аффинный сорбент.Рисунок 8 – Масс-спектрыобразца, содержащего пептический гидролизат сывороточного альбумина человека, модифицированногозоманом: 1 (снизу) – исходный образец; 2 (сверху) –проскок с сорбента.Аналогичный эксперимент был проведен для хромита лантана (рис. 9). При десорбции фосфорилированных пептидов с сорбента их концентрация увеличиваетсяпо сравнению с исходным образцом концентрация фосфорилированных пептидоввозрастает, что говорит о возможном использовании хромита лантана для обогащения фосфорилированных пептидов.Рисунок 9 – Масс-спектрыобразца, содержащего пептический гидролизат сывороточного альбумина человека,модифицированного зоманом: 1 – исходный образец; 2– последовательная промывка водным раствором аммиака, 3 – раствором, содержащим 50% ацетонитрила и0,1% ТФУ.Обоснование выбора сорбента для фосфопротеомных исследованийПо результатам физико-химических исследований были определены преимущества и недостатки металл-хелатного и металл-оксидного сорбентов.
Для коллапсированных монослоев на основе стеарата лантана отмечена простота получения, дешевизна реактивов, отсутствие побочных реакций и продуктов. Хромит лантана всвою очередь имеет большую площадь удельной поверхности и может быть полученнепосредственно в бытовой микроволновой печи, однако хромит лантана характеризуется сложной формой агрегатов, которые не поддаются дезагрегации, получение хромита лантана сопровождается побочной реакцией окисления хрома. В результате, в качестве металл-аффинного сорбента для фосфопротеомного анализабыл выбран пленочный стеарат лантана.14Исследование сорбционных свойств фосфорилированных пептидов на сорбентах, содержащих лантанМонослой стеарата лантана, перенесенный на твердую подложку методом Ленгмюра-Блоджетт, обработалифосфорилированным бычьим казеином (1мг/мл, рН 3.0, 18 кДа) в течение20 минут.
Для исключения неспецифической сорбции пластинку промыли0,1 % раствором ТФУ (рН 3.0). Затембычий казеин десорбировали 2% раствором аммиака. Весь процесс контролировался методом атомно-силовоймикроскопии (рис. 10). Как видно намикрофотографиях, сорбция проходитуспешно, так же и десорбция глобулказеина вполне успешна в условияхклассической металл-аффинной хромаРисунок 10. а – кремниевая подложка до тографии.Количественную оценку сорбционпереноса; б – монослои на кремниевойподложке; в – монослой с глобулами ка- ной ёмкости проводили по пептидузеина после сорбции и промывки; г – мо- SSNGHV(pY)EKLSSI.
Сорбция проводилась из кислой среды (pH=2) в принослой после десорбции.сутствии 0,1% ТФУ, десорбция проводилась растворами аммиака, пиперидина и имидазола (щелочная среда). Содержаниепептида во фракциях определяли методом ВЭЖХ-УФ. Сорбционная емкость по количеству пептида в проскоке 50 дм2 сорбента (15 мг стеарата лантана) составила 20мкг пептида, что при пересчете на коммерческий аналог (50 мг сорбента на однуколонку) составляет 67 мкг. Этот результат превосходит данные, указанные для распространенного коммерческого сорбента Titansphere Phos-TiO (50 мкг/50 мг).
Результат воспроизвелся для пептида FGE(pS)AGAAS. Так же была определена емкость сорбента для смеси двух указанных пептидов в тех же условиях. Количественный анализ по методике показал, что 15 мг сорбента удерживает 11 мкг и 9 мкг пептидов SSNGHV(pY)EKLSSI и FGE(pS)AGAAS соответственно, что согласуется с результатами, полученными для каждого из пептидов в отдельности.Показано, что селективная сорбция фосфорилированных пептидов проходит приpH=8, при этом для проведения эффективной сорбции и во избежание перегрузкисорбента, количество образца не должно превышать 25 мкг в пересчете на начальную концентрацию белка на 50 дм2 (15мг) сорбента (рис.
11).15Рисунок 11 – МАЛДИ массспектр образца, содержащегопептический гидролизат сывороточного альбумина человека, модифицированногозоманом: 1 – гидролизат допроведения металл-аффинной хроматографии; 2 – проскок с колонки с нагрузкой25 мкл гидролизата на 15 мгсорбента; 3 – проскок с колонки с нагрузкой 50 мклгидролизата на 15 мг сорбентаЭффективная селективная адсорбция фосфорилированных пептидов на МХСпривносит некоторые сложности в задачу выбора состава элюента. В качестве десорбирующих агентов были испробованы водные растворы донорных растворителей пиперидина, имидазола, ацетонитрила. Показано, что только в элюате 50% и70% водного ацетонитрила присутствуют искомые сигналы. Анализ показал, что однократная обработка 70% водным ацетонитрилом высвобождает около 25% сорбированных аддуктов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
