Автореферат (1150272), страница 4
Текст из файла (страница 4)
В нейтральной и щелочной среде чувствительность сенсора ккофеину отсутствовала, а в кислой среде сенсор давал отклик на изменение концентрациипротонированной формы кофеина. При рН 2 крутизна электродной функции составила 52 ± 1мВ/-lg C в области линейности электродной функции 10-5 - 10-2 М.Учитывая, что такого рода мембраны имеют перекрестную чувствительность, проявляяотклик ко многим компонентам анализируемой среды, необходимо было изучитьселективность сенсора к компонентам слюны, которые будут присутствовать в ней после peros применения кофеина. В первую очередь, к сходным по составу и свойствам метаболитамкофеина, алкалоидам пуринового ряда – теофиллину, теобромину и параксантину.
НаРисунке 8 показаны калибровочные зависимости кофеина, теобромина, теофиллина ипараксантина при рН 2. Мешающее влияние метаболитов наблюдается в диапазонеконцентраций, соответствующем содержанию этим компонентов в слюне.Особое внимание в работе было уделено изучению условий проведения капельноймикроэкстракции кофеина и его метаболитов для устранения мешающего влияния последнихна потенциометрическое определение кофеина в слюне.Рисунок 8.
Зависимости ЭДС измерительной ячейкиот концентрации кофеина и его метаболитов.Для оптимизации капельной микроэкстракции было изучено влияние различныххлорорганическихэкстрагентов(хлороформ,хлористыйметилен,хлорэтан,13четырёххлористый углерод) на степень извлечения кофеина, теофиллина, теобромина ипараксантина.
Основными требованиями к выбору экстрагента для капельноймикроэкстракции являются высокая степень извлечения аналита, низкая растворимость вводной фазе и устойчивость образования капли на конце иглы. Хлорорганическиеэкстрагенты в той или иной степени отвечают указанным требованиям.Было обнаружено, что наиболее эффективным экстрагентом является хлороформ,который обеспечивает максимальное извлечение кофеина при минимальной экстракцииметаболитов (Рисунок 9А), таким образом, устраняя их мешающее влияние.Рисунок 9.
Степень извлечения алкалоидов в растворы различных хлорорганических экстрагентов(А); Влияние времени экстракции на степень извлечения алкалоидов в каплю хлороформа (Б).Концентрация алкалоидов 10-4 М, рН=2, объем пробы 0,3 мл, объем экстрагента 1 мкл.Следует отметить, что капли объемом больше 1 мкл были нестабильными ипроисходил их отрыв с иглы микрошприца.
Выбранный объем экстрагента 1 мклобеспечивает стабильность капли в ходе эксперимента и воспроизводимость результатованализа (СКО ≤ 3%).Кроме того, было изучено влияние объема пробы на степень извлечения кофеина вкаплю хлороформа. Объем пробы варьировали от 0,1 до 0,5 мл, при этом концентрациякофеина в пробе была постоянной и составляла 10-4 М (рН = 2).
При увеличении объемапробы происходило увеличение аналитического сигнала, при объеме пробы 0,3 мланалитический сигнал достигал своего максимального значения и не увеличивался вдальнейшем, что обусловлено незначительным коэффициентом распределения кофеина ввыбранной системе (Kd = 2).На следующем этапе оптимизации условий микроэкстракции кофеина в каплюхлороформа было изучено время, необходимое для достижения равновесия в системе:водный раствор пробы – хлороформ (Рисунок 9Б). Было установлено, что для достижениямаксимальной степени извлечения достаточно 3 мин.Для потенциометрического определения кофеина после капельной микроэкстракциинеобходимо произвести замену растворителя, поскольку хлороформ разрушает мембранусенсора.
На первом этапе необходимо удалить экстрагент. Для этого поток воздухапропускали через смесительную камеру. Было отмечено, что при подаче воздуха соскоростью 1 мл/мин в течение 4 мин происходит испарение капли хлороформа.Влияние объема раствора кислоты на эффективность растворения аналита былоизучено при варьировании различных объемов 0,01 М H2SO4 в диапазоне от 0,1 мл до 0,5 мл.Было установлено, что 0,3 мл кислоты являются оптимальными, обеспечивая минимальноезначение СКО (< 3 %) при минимальном объеме растворителя.Для определения кофеина в слюне волонтеры (от 18 до 35 лет) принимали 200 мглекарственного препарата «кофеин-бензоат натрия» per os. После предварительного14ополаскивания полости рта водой через 4 часа после приема препарата собирали 3 мл слюны.Первый образец слюны собирали вечером накануне, результат анализа которого принимализа значение холостой пробы. 1 мл отобранной слюны помещали в пробирку дляцентрифугирования и добавляли 1 мл воды.
Полученные растворы центрифугировали втечение 5 мин при 5000 об/мин.Для проточного потенциометрического определения кофеина в слюне (Рисунок 7) 0,3мл супернатанта слюны (а) отбирали с помощью шприцевого насоса в удерживающуюспираль и далее направляли в смесительную камеру. После этого с помощью микрошприцавыдавливали каплю объёмом 1 мкл предварительно отобранного хлороформа в глубинераствора на расстоянии 5 мм от поверхности. В течение трёх минут происходилмассоперенос кофеина из пробы в каплю экстрагента.
После чего пробу сбрасывали, а каплюэкстрагента выдавливали в смесительную камеру, которую затем продували воздухом спомощью шприцевого насоса, при этом происходило испарение хлороформа. Затем всмесительную камеру подавали 0,3 мл раствора 0,01 М H2SO4 (б) для создания рН=2 иперевода кофеина в протонированную форму, а также воздух для перемешивания раствора.После этого раствор направляли в электрохимическую ячейку для измерения разностипотенциалов. После этого систему промывали дистиллированной водой (в).Для подтверждения правильности полученных результатов параллельно проводилианализ при помощи методики ВЭЖХ. Результаты определения кофеина в слюнепредставлены в таблице 3.
Полученные F-значения ≤ 6,4 указывают на незначительноеразличие в величинах стандартных отклонений, а полученные t-значения ≤ 2,78 указывают нато, что нет статистически значимого различия между результатами, полученными припомощи методик ЦИА и ВЭЖХ.Таблица 3. Результаты определения кофеина в пробах слюны (n = 5, P = 0,95, Fкр = 6,4, tкр = 2,78).Проба123Найдено кофеина в слюне, 10-4 МЦИАВЭЖХ19,1±0,419,2±0,516,0±0,416,6±0,429,2±0,728,0±0,7F-значениеt-значение2,33,82,71,81,71,1Отсутствие селективности потенциометрического определения кофеина в слюне былоэффективно компенсировано использованием метода капельной микроэкстракции и заменойрастворителя.
Предложенная схема анализа может быть реализована при определении идругих аналитов в биологических жидкостях, способных извлекаться в легколетучиехлорорганические растворители. Следует отметить, что впервые разработана проточнаяметодика определения кофеина в слюне. Аналитические характеристики разработаннойметодики представлены в таблице 4. Методика обеспечивает полную автоматизацию анализас низким расходом пробы и растворов реагентов.Таблица4.Аналитическиехарактеристикиметодикициклическогопотенциометрического определения кофеина в слюне.Диапазон определяемых10-5 – 10-3концентраций, МПредел обнаружения, М8·10-72Коэффициент корреляции, r0,998СКО (n = 5), %5Объем пробы, мл0,3Объем 0,01 М H2SO4, мл0,3Объем экстрагента, мкл1Время анализа, мин1015инжекционногоГлава 5.
Комбинированный проточный метод, основанный на сочетании циклическогоинжекционного анализа и метода комбинированных градуировокЖидкостная микроэкстракция практически непригодна для выделения аналитическихформ, обладающих преимущественной растворимостью в водной фазе. В этом случаеиспользуют альтернативные методы разделения и концентрирования или другие подходы,которые позволяют учесть мешающее влияние матрицы пробы. Одним из таких подходовявляется метод комбинированных градуировок, представляющий собой комбинацию методаградуировочного графика и метода стандартных добавок, обеспечивающий возможностьоптимизации процедуры on-line разбавления пробы для устранения влияния матричныхэффектов.В данной работе была изучена возможность реализации МКГ в условиях ЦИА.
Дляэтого в шести однотипных смесительных камерах (Рисунок 10) осуществляется разбавлениепробы, проведение аналитической реакции, добавление стандартного раствора аналита вопределенном соотношении для построения градуировочных зависимостей при даннойстепени разбавления пробы. В смесительные камеры, с помощью перистальтического насосачерез однотипные краны-переключатели, подаются порции пробы, реагентов, разбавителя истандартного раствора. После перемешивания растворов в смесительных камерах газовойфазой, они направляются последовательно в детектор.Рисунок 10.
Схема ЦИА для реализации метода комбинированных градуировок. СКN – смесительнаякамера.В качестве аналита для подтверждения возможностей метода был выбран изониазид,который используется в составе комплексных препаратов для эффективного лечениятуберкулеза. Высокие концентрации изониазида в организме человека являются токсичными.Поэтому важной задачей клинической диагностики является оптимизация режимовдозирования изониазида в зависимости от особенностей метаболизма пациентов.Изониазид определяли по реакции образования окрашенного комплекса сметаванадатом аммония (МВА). Образование комплекса происходит мгновенно, однако,наблюдается и его быстрое разрушение (Рисунок 11А). Неустойчивость аналитических формограничивает возможность их применения в ЦИА при реализации МКГ, так как с цельюсокращения времени анализа образование аналитических форм в смесительных камерахдолжнопроисходитьодновременноспоследующимихпоследовательнымфотометрированием.
В работе было выявлено, что добавление цитрат-ионов повышаетустойчивость аналитической формы (Рисунок 11А). При этом происходит образованиесмешанного окрашенного комплекса изониазида с метаванадат- и цитрат-ионами.16Рисунок 11 А: Влияние цитрат-ионов на устойчивость комплекса метаванадат-ионов с изониазидом;Б: Спектры поглощения: 1 – комплекс изониазида с МВА и цитрат-ионами, 2 – комплекс изониазидас метаванадат-ионами, 3 – раствор МВА (изониазид 100 мкМ, МВА 0,6 мМ, рН 2,2).Поскольку МВА и моча являются окрашенными растворами, было необходимоубедиться в отсутствии перекрывания спектров поглощения. Для этого были сняты спектрыМВА, комплекса МВА и изониазида и комплекса, образованного в присутствии цитрат-ионов(Рисунок 11Б).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
