Диссертация (1149296), страница 12
Текст из файла (страница 12)
3.27. Калориметрическая изотерма связывания соединения 11 с ДНК:зависимость удельной теплоты, выделившейся при каждой инъекции соединения,от отношения Слиг/CДНК. Сплошная линия соответствует модели идентичныхнезависимых мест связывания.Расчет показывает, что параметры первичного связывания соединения 11близки по величине параметрам связывания с ДНК соединений 9 и 10:n=0.23±0.02K=(2.6±0.6) ·105М-1H=(-8.61±0.87) ккал/мольПолученные по данным ИКТ значения Ксв позволяют рассчитать свободнуюэнергиюсвязываниясоединения 9соединения 10Следовательно,(ΔG)(2.12).поСвободнаяданнымИКТ,энергиявзаимодействиясоставляетΔG9=-6.7сДНКккал/моль,ΔG10=-6.6 ккал/моль, соединения 11 ΔG11=-7.3 ккал/моль.энтропийныйвкладвобразованиекомплексов:TΔS9 = -1.4 кал/моль, TΔS10 = -0.7 ккал/моль, TΔS11 = -1.3 ккал/моль.Сопоставление результатов СФТ и ИКТ показывает, что оба метода даюттолько качественное соответствие результатов, в то время как количественныеданные о константах связывания различаются в несколько раз.Вискозиметрия и динамическое двойное лучепреломление.
Для определения79способа связывания лигандов с ДНК в области первичного связывания (r =0.2)использовалиметодывискозиметриииДЛП.Результатыизмеренияхарактеристической вязкости и отношения Петерлина представлены в таблицах3.5 и 3.6.Таблица 3.5. Гидродинамические и оптические характеристики растворов ДНК иее комплексов с пирроло- изохинолинами.,-7rCДНК,%ηrΔn/g·10 , см·с2/кг-0.00351.53±0.0514±126 ± 20.2 0.00351.65±0.0517±126 ± 2ДНК – 10 соед. 0.2 0.00351.76±0.0520±126 ± 2ДНК – 11 соед. 0.2 0.00351.75±0.0519±125 ± 2КомплексДНКДНК – 9 соед.Таблица 3.6. Характеристическая вязкость и изменение контурной длинымакромолекулы в составе ее комплексов с пирроло-изохинолинами.КомплексrДНК0[η], м3/кг (Lr/LДНК)эксп.--0.2 17.4 ± 1.51.10±0.051.2ДНК – 10 0.2 17.5 ± 1.51.11±0.051.2ДНК – 11 0.2 18.2 ± 1.51.13±0.051.2ДНК – 915 ± 1(Lr/LДНК)теор.
инт.Увеличение характеристической вязкости наблюдается при образованиикомплекса ДНК со всеми соединениями. В случае высокомолекулярной ДНКподобные изменения могут быть вызваны как увеличением контурной длины, таки увеличением термодинамической жесткости макромолекулы, определяемой подлине статистического сегмента (A).Величина соотношения Петерлина, пропорциональная термодинамической80жесткости макромолекулы, остается в пределах погрешности постоянной(таблица 3.5). Следовательно, увеличение характеристической вязкости ДНК прикомплексообразовании с соединениями происходит в результате изменения ееконтурной длины.
При неизменной термодинамической жесткости верносоотношение (3.1).При классической интеркаляции лиганда в двойную спираль ДНК приr=0.2контурнаяL0.2/L0 =1.2 раза (1.1).длинамакромолекулыдолжнаувеличиватьсявРасчет показывает (таблица 3.6), что экспериментальнополученное изменение контурной длины молекулы ДНК меньше величины,присущей классической интеркаляции молекул связанного лиганда в двойнуюспираль ДНК.
Можно предположить, что соединения этой группы связываются смолекулой ДНК с помощью частичной или неполной интеркаляции [48].ВыводыЗависимость способа связывания соединений от их структуры. По своейструктуре все три соединения отличаются лишь заместителем по азоту.
Все трилиганда взаимодействуют с ДНК похожим способом при первичном связывании,однако наличие дополнительного заряда на громоздком заместителе у соединения11 приводит к возникновению вторичного связывания.814. БензоимидазофталазиныВработебылиисследованысоединения,производныебензоимидазофталазина, синтезированные в НИИ гигиены, профпатологии иэкологии человека [143]. Структурные формулы представлены на рис. 4.1 и втабл. 4.1. Все соединения хорошо растворяются в спирте и ограниченно в воде.NR1NNR2Рис 4.1.
Структура исследуемых соединений.Таблица 4.1. Структурные формулы исследуемых соединений.82Все исследованные соединения имеют длинноволновую полосу поглощенияв области λ=(270–400) нм. Поглощение гетероциклических соединений в этойобласти обусловленоπ-π электронными переходами, поляризованными вплоскости хромофора. Основная полоса поглощения имеет интенсивныймаксимум при λ=(290–320) нм и низко-интенсивный максимум (или плечо) приλ=(330-370) нм (рис. 4.2). Длинноволновую полосу поглощения можно разложитьна две составляющие, соответствующие двум электронным переходам: рис. 4.3.У соединений, не имеющих циклического электронодонорного заместителяв положении R1 (пиперидин, морфолин, пиперазин), спектр поглощения смещен вкоротковолновую область, а длинноволновое плечо отсутствует (рис.4.2,соед.
24). Спектр поглощения таких соединений очень сильно перекрывается соспектром поглощения ДНК и не позволяет проводить исследование ихвзаимодействия используемыми в работе методами. В то же время это позволяетсделать предположение, что поглощение в области λ=(330-370) нм соответствуетэлектронному переходу, поляризованному вдоль длинной оси хромофора, наположение которого оказывает влияние наличие электронодонорного заместителяв положении 1.831,61,4211,2D1,00,8170,60,42322240,20,0240260280300320340360380400420, нмРис.
4.2. Спектры поглощения соединений в этиловом спирте (цифры награфике - номера соединений). Толщина кюветы 2см, концентрации соединений:С17=2.7·10-5М, С21=2.3·10-5М, С22=1.2·10-5М, С23=1.5·10-5М, С24=1.4·10-5М.10,8D0,60,420,230,0300350400, нмРис.4.3. Разложение спектра поглощения соединения 22 (1) на двесоставляющие (2 и 3), толщина кюветы 2см, С22=1.2*10-5М.Длявсехисследуемыхэкстинкции в спирте (табл. 4.2).веществбылиопределеныкоэффициенты84Таблица 4.2.
Коэффициенты экстинкции бензоимидазофталазинов в спирте.СоединениеКоэффициент экстинкции, 103М-1см-112Ɛ308=11.0±0.213Ɛ309=30.9±0.614Ɛ311=32.9±0.615Ɛ308=32.1±0.616Ɛ308=27.1±0.617Ɛ308=24.7±0.518Ɛ309=29.2±0.619Ɛ311=30.7±0.620Ɛ295=30.1±0.521Ɛ305=24.9±0.522Ɛ312=32.1±0.623Ɛ313=35.7±0.724Ɛ313=35.7±0.7В связи с плохой растворимостью в воде, исследуемые соединениярастворялись в этиловом спирте. Для приготовления водно-солевых растворовкомплексов небольшие объемы спиртовых растворов соединений добавлялись вводно-солевые растворы, содержащие различную концентрацию ДНК. Вконечных растворах содержание спирта не превышала 2%, что не оказываловлияния на структуру ДНК и ее взаимодействие с лигандами.
Однако такоеприготовление растворов затрудняет использовать микрокалориметрическоетитрование для определения термодинамических параметров связывания.Дляопределенияэтихпараметровбылипроведеныспектрофотометрические (СФ) титрования с независимым приготовлениемрастворов с одинаковой концентрацией лиганда и различной концентрацией ДНК(1-ый способ в «Методы» п. 2.1).85Спектрофотометрические исследованияПри СФ титровании концентрация лигандов в растворе сохраняласьпостоянной и для разных соединений находилась в пределах (0.5-1.0) ·10-5М.Концентрация ДНК изменялась в пределах 0≤СДНК≤12.3 М (пар оснований).По характеру изменений спектров поглощения лиганда в присутствии ДНКсоединения могут быть разделены на три группы.К первой группе относятся производные бензоимидазофталазина, имеющиев положении 1 остаток пиперазина (соед.
21-23) или морфолина (соед.17).У этих соединений с увеличением концентрации ДНК в растворенаблюдается уменьшение интенсивности в основном максимуме и увеличениеинтенсивности и батохромный сдвиг длинноволнового плеча спектра поглощениялиганда. В качестве примера на рис.4.4приведены кривые титрованиясоединения 22.1,501,25(0,2)(0,3)(0,43)(0,71)CDNA=0D1,000,750,500,25(1,06)(2,32)(5,32) (3,04)0,00300350400450,нмРис. 4.4. Спектры поглощения при титровании соед.22 при постояннойконцентрации лиганда, равной 1·10-5М, µ=0.001 (цифры в скобках соответствуютотношению Слиг/СДНК), толщина кюветы 5 см.При λ < 300 нм имеет место перекрывание спектра лиганда со спектромпоглощения ДНК.
Разностные спектры поглощения растворов комплекса и чистойДНК соответствующей концентрации для соединений 17 и 21 приведены нарис. 4.5 и 4.6. Следует отметить, что эти спектры были получены при86концентрации лиганда 5·10-5М, что не исключает образования вторичногоагрегационного связывания лиганда с ДНК.0,80,70,6СДНК=0D0,5(4.31)(2.18)(1.12)(0.76)(0.58)(0.48)(0.35)0,40,30,20,10,0(0.32)(0.29)300(0.26)(0.10-0.23)320340360380400420440460480500520540нмРис.
4.5. Спектры поглощения при титровании соед.17 при постояннойконцентрации лиганда, равной 5·10-6М, µ=0.001, толщина кюветы 1 см.0,400,350,30D0,25(0.05)(0.10)(0.27)(0.55)(0.85)(1.38)0,200,150,10СДНК=00,05(4.06)0,00300320340360380400420нмРис. 4.6. Спектры поглощения при титровании соед.21 при постояннойконцентрации лиганда, равной 5·10-5М, µ=0.001, толщина кюветы 1 см.На кривых титрования производного с морфолиновым заместителем(рис. 4.5) наблюдается изобестическая точка, свидетельствующая об одном типесвязывания лиганда с ДНК. У пиперазинового производного (рис.
4.6)87изобестическая точка отсутствует, что говорит о наличии более одного типасвязывания.Для расчетов термодинамических параметров связывания, чтобыисключить влияние возможных изменений в спектрах ДНК, мы проводили СФТ вобласти длин волн более 340 нм. А для исключения возникновения вторичногосвязывания у пиперазиновых производных использовали минимально возможнуюконцентрацию лиганда 1·10-5М.СФТ в этой области соединений 17 и 21представлено на рис 4.7 и 4.8, соответственно.0,70,60,5(0,21)0,4D(0.45)(0.67)(0.88)0,3(1,06)0,2(10.64)0,1(5.05-1,43)CДНК=00,0340360380400420440460480500,нмРис. 4.7. Спектры поглощения при титровании соед.17 при постояннойконцентрации лиганда, равной 1·10-5М, µ=0.001 (цифры в скобках соответствуютотношению Слиг/СДНК) , толщина кюветы 5 см.880,7(5,32)0,6(3,04)(10,64)0,5(0,30)0,4D(0,43)0,3(0,71)(1,06)(2,13)0,20,10,0340CДНК=0360380400420440460,нмРис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
