Диссертация (1145906), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Внесение аллелейsup35-M2 и sup35-M4 в штаммы, содержащие sup35-M3 или sup35-M5, приводилок увеличению размера агрегатов (Рис. 31), что совпадает со слабым ростомсоответствующих штаммов на среде без аденина (Рис. 30). К аналогичномуэффекту приводило и комбинирование мутации sup35-M2 с sup35-M4 (Рис. 31).Таким образом, для всех случаев дестабилизации приона мы детектировалиувеличение размера агрегатов Sup35p.82Рисунок 31.
Дестабилизация приона [PSI+] сопровождается увеличением размераагрегатов Sup35p. Представлены результаты SDD-AGE агрегатов Sup35p, образованныхразличными мутантными белками. Над каждой панелью указана аллель SUP35,поддерживающая прион; над отдельными пробами перечислены аллели, которые были внесеныв клетки. Прямоугольником выделены контрольные варианты (штаммы, несущие двеодинаковые аллели SUP35).
Для детекции Sup35p использовали поликлональные антитела кeRF3.6.3.3. Сочетания мутаций sup35KK модифицируют термостабильностьагрегатов Sup35pДля сравнения термостабильности гетероагрегатов Sup35p был использованмодифицированный SDD-AGE: перед нанесением пробы инкубировали приразличных температурах. Все эксперименты проводились минимум в двухповторностях. Обработка результатов осуществлялась в программе ImageJ. Наосновании полученных данных нам удалось выяснить, что в присутствииsup35-M3 все другие мутации приводят к формированию более устойчивыхагрегатов (Рис. 32).
Для аллели sup35-M4 эффект обратный и гораздо менеевыраженный. Комбинация sup35-M5 с мутациями sup35-M3 или sup35-M4приводит к увеличению термостабильности агрегатов, в то время как сочетаниеsup35-M5 с sup35-M1 или sup35-M2 приводит к противоположному эффекту.83Рисунок 32. Мутации sup35KK приводят к изменению термостабильности прионныхагрегатов. Сравнение термостабильности гетероагрегатов мутантных вариантов Sup35p.
Надграфиками указаны аллели SUP35, поддерживающие [PSI+]. На графиках более жирной линиейвыделены контрольные варианты (штаммы, несущие две одинаковые аллели SUP35). Обработкуизображений проводили с помощью программы ImageJ 1.47i. Во всех случаях длянормализации полученных данных за 100% принято количество агрегированного Sup35p при25оС. Приведены средние значения, для каждой точки отложено стандартное отклонение.6.4. Зависимость эффектов мутаций sup35KK от варианта приона [PSI+]Фактор [PSI+] характеризуется наличием вариантов (Derkatch et al., 1996),свойства которых зачастую связаны непосредственно со структурой агрегатовSup35p (King, 2001; Chang et al., 2008).
Эффекты мутаций, влияющих настабильность [PSI+], зачастую являются вариант-специфичными (Derkatch et al.,1999; King, 2001; Lin et al., 2011). В связи с этим необходимо было сравнитьвлияние мутаций sup35KK на стабильность различных вариантов приона.Для этой части работы были подобраны штаммы дрожжей, несущиеварианты приона, отличающиеся от варианта, ранее использованного в работе(дрожжевой штамм 10-7A-D832, предоставленный А.С.
Борхсениусом). Нарисунке 33 представлен нонсенс-супрессорный фенотип этих штаммов. ШтаммыOT являются изогенными и отличаются только вариантом [PSI+].84Рисунок 33. Нонсенс-супрессорный фенотип штаммов с различными вариантами [PSI+].На рисунке представлен посев с 5-кратными разведениями на среде без аденина длядемонстрации различий в силе супрессорного фенотипа вариантов [PSI+] по сравнению соштаммом, использованным в предыдущих экспериментах (10-7A-D832).Штаммы с различными вариантами [PSI+] трансформировали плазмидамиpRSU1, несущими различные аллели SUP35. Поскольку хромосомная копияSUP35 в этих штаммах была функциональной, мы смогли проанализироватьэффекты мутаций только в присутствии аллели дикого типа.
Для проверкинонсенс-супрессорного фенотипа полученных трансформантов переносили насреду 1/4 YEPD (Рис. 34). Влияние мутаций sup35KK на стабильность приона вбольшой степени зависело от варианта [PSI+]. При этом какой-либо корреляциивыявить не удалось. В частности, ни одна из мутаций не оказывала заметноговлияниянасильныйвариант[PSI+]s.Мутацияsup35-M3частичнодестабилизировала, а sup35-M2 — ослабляла [PSI+]nss1 и [PSI+]nss2. Прион [PSI+]wтерялся в присутствии sup35-M1.Рисунок 34. Эффекты мутаций sup35KK зависят от варианта приона [PSI+]. В качествепримера представлен фенотип трансформантов, несущих мутации sup35-M1 — sup35-M3, насреде 1/4 YEPD.856.5. Эффекты мутаций sup35KK не зависят от [PIN+]-статуса клетокПрион [PIN+] в клетках дрожжей необходим для появления [PSI+] de novo(Derkatch et al., 1997).
Структурным геном этого фактора является RNQ1 (Derkatchet al., 2001). Для того, чтобы проверить, могут ли описанные эффекты мутацийsup35KK быть опосредованы присутствием фактора [PIN+], мы получилипроизводные [PSI+] и [psi-] штаммов (10-7A-D832 и 7A-D832) с делецией генаRNQ1. [PSI+] и [psi-] штаммы с делецией гена RNQ1, либо его нормальной копиейтрансформировали плазмидами pRSU1 с мутациями sup35KK. У трансформантовпроверяли наличие нонсенс-супрессорного фенотипа в присутствии аллели дикоготипа, а также после ее потери (Рис. 35). Мы не обнаружили отличий в эффектахисследуемых мутаций между клетками [PIN+] и [pin-], это говорит о том, чтовлияние sup35KK на свойства приона [PSI+] не связано с наличием [PIN+].Рисунок 35.
Эффекты мутаций sup35KK не зависят от [PIN+]-статуса клеток. Представленфенотип клеток, несущих различные аллели sup35KK, на среде 1/4 YEPD. Над панелями указан[PSI+][PIN+] статус клеток. Мутации sup35-M1 и sup35-M2 приводят к исчезновению приона,sup35-M4 и sup35-M5 изменяют свойства [PSI+].866.6. Характеристика фибрилл, образованных мутантными белками in vitroЭкспериментымутантнымипоSup35p,исследованиюструктурыпроводилисистемевфибрилл,invitro.образованныхСпомощьюсайт-направленного мутагенеза мы сконструировали серию плазмид на основеpET21b-SUP35NM. Эти плазмиды были предназначены для сверхэкспрессииNM-домена Sup35p или его мутантных вариантов в клетках штамма BL21 E.
coli.Для работы был выбран укороченный вариант Sup35p, поскольку в формированиифибрилл участвует только NM-домен (King et al., 1997; Baxa et al., 2011). Всеконструкции SUP35NM были слиты с фрагментом, кодирующем шестьгистидинов, благодаря этому синтезируемые белки можно было очищать наникелевых колонках и таким образом получать их в препаративных количествах.Перед началом экспериментов была проведена серия опытов для подбораоптимальных условий сверхпродукции и очистки белков.
Мы проверили эффектыследующих факторов: концентрация ИПТГ (от 1 до 3 мМ), время индукции(от 2 до 6 часов), а также условия культивирования (среда LBа или 2TYа). Вкачестве примера на рисунке 36 приведены результаты эксперимента по подборувремени индукции. Основываясь на полученных данных, подобрали оптимальныеусловия. В ходе дальнейшей работы синтез белка в клетках бактерийиндуцировали добавлением ИПТГ до концентрации 1 мМ в течение 6 часов при37оС в среде 2TYа.Лизис клеток осуществляли в денатурирующих условиях в присутствии8М мочевины. В ходе очистки на колонках с Ni-NTA Agarose (Invitrogene) клизатам добавляли имидазол в концентрации 5 мМ, при смыве целевого белка сколонки использовали имидазол в концентрации 450 мМ. На завершающем этапебелок концентрировали не менее чем до 500 мкМ.
Молярную концентрациюопределяли по поглощению раствора при длине волны 280 нм (коэффициентеэкстинкции Sup35NMp 25600) (Gill et al., 1989; Lin et al., 2011).87Рисунок 36. Подбор времени индукции сверхпродукции Sup35NMp в клетках E. coli.Представлены результаты SDS-PAGE лизатов бактерий, в которых сверхпродукция белкаосуществлялась в течение различного времени. Белки окрашивали Кумасси G-250.Для получения фибрилл, образованных различными вариантами Sup35NMp,соответствующий белок разводили в 5мМ фосфатном буфере (pH 7,4) c 150 мМNaCl как минимум в 100 раз до конечной концентрации в 5 мкМ. Эти условияявляютсяприближеннымикфизиологическим.Полученныйрастворинкубировали при 25оС и аккуратном перемешивании. Эксперимент проводили втрех повторностях.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
