Диссертация (1145906), страница 16
Текст из файла (страница 16)
Процесс образования агрегатов Sup35NMp отслеживали поуменьшению количества мономерного белка с помощью SDS-PAGE (крупныеагрегаты не могут входить в полиакридамидный гель). Для каждого раствораделали по две пробы, одну из которых кипятили в присутствии SDS, а вторуюинкубировали при 25оС. Гели после SDS-PAGE окрашивали Кумасси G-250. Нарисунке 37 представлены результаты эксперимента по получению фибриллSup35NMp дикого типа. Последующую обработку изображений проводили спомощью программы ImageJ. Долю мономерного Sup35NMp оценивали какотношение количества белка в некипяченой и кипяченой пробах (инкубацияагрегатов Sup35p в SDS при 100оС приводит к их полной диссоциации).88Рисунок 37. Формирование агрегатов Sup35NMp дикого типа in vitro.
На рисункепредставлены результаты SDS-PAGE с кипячеными (100 оС) и не кипячеными (25оС) пробами,отобранными в различные промежутки времени. Уменьшение количества белка в пробах,инкубированных при 25оС по отношениею к кипяченым пробам, свидетельствует об появленииагрегатов Sup35NMp.Согласно полученным данным, почти все мутантные белки Sup35NMp неотличаются по скорости формирования агрегатов. Исключением является толькоSup35NM-M5p, агрегаты которого появлялись значительно медленнее посравнению с другими Sup35NMp (Рис. 38).Рисунок 38. Белок Sup35NM-M5 медленнее образует агрегаты in vitro. На рисункепредставлено сравнение динамики образования агрегатов различных Sup35NMp. Долюмономерного белка рассчитывали как соотношение количества мономерного белка к общему(пример на рисунке 37).
Каждый эксперимент проводили в трех повторностях, на графикепредставлены средние значения. Для каждой точки отложено среднеквадратичное отклонение.В ходе предыдущего эксперимента удалось доказать, что мутантные белкиSup35NM формируют SDS-устойчивые агрегаты. Для исследования морфологииэтих агрегатов использовали просвечивающую электронную микроскопию.Агрегаты белков переносили на сеточки с формваровой подложкой и окрашивали1 % уранил ацетатом согласно протоколу методики позитивного контрастирования(Brumetal.,2010).Анализпрепаратовосуществлялиспомощьюпросвечивающего электронного микроскопа JEM Jeol-2100 на базе ресурсного89центра «Развитие молекулярных и клеточных технологий» СПбГУ.
Во всехслучаях нам удалось обнаружить фибриллы, образованные Sup35NMp (Рис. 39).Рисунок 39. Все мутантные белки Sup35NM образуют фибриллы in vitro. Представленымикрофотографии агрегатов Sup35NMp. Образцы окрашены 1 % уранил ацетатом согласнометодике позитивного контрастирования.90На следующем этапе мы сравнили линейные характеристики полученныхфибрилл, а именно длину и ширину. Оба этих параметра измеряли помикрофотографиям в программе ImageJ. При сравнении длин проводилиизмерения ста фибрилл. Для определения ширины измеряли по десять фибрилл втрех точках.
Полученные данные сравнивали с помощью непараметрическогокритерияВилкоксона(использованиепараметрическихметодовбылонецелесообразным, поскольку распределения не были нормальными). Результатысравненияшириныфибрилл,образованныхмутантнымибелками,продемонстрировали, что все агрегаты достоверно шире контрольного варианта(белка дикого типа) (Рис. 40). Это доказывает, что исследуемые мутациидействительно оказывают влияние на структуру агрегатов Sup35p.Рисунок 40. Мутации sup35KK приводят к изменению ширины агрегатов Sup35NMp in vitro.В виде «ящиков с усами» (boxplot) представлены распределения значений ширины дляфибрилл, образованных различными Sup35NMp.
Достоверные отличия по сравнению с белкомдикого типа, рассчитанные с помощью теста Вилкоксона, отмечены «*» ( * - p < 0,05,*** - p < 0,001).Поскольку процесс агрегации белка in vitro ничем не ограничивается, длинафибрилл теоретически должна определяться преимущественно скоростьюприсоединениякнейновыхмолекулбелка,и,вменьшейстепени,интенсивностью появления затравок (спонтанно формирующихся небольшихагрегатов). При очень высокой эффективности образования этих затравок средняядлина фибриллы может оказаться ниже (в случае одинаковых скоростей агрегации91белка).
Отдельно стоит отметить, что препараты не отличались по по количествуфибрилл при визуальном сравнении. Согласно полученным данным, фибриллыSup35NM-M1p и Sup35NM-M2p короче по сравнению с Sup35NMp, в тоже времябелок Sup35NM-M4p образует более длинные агрегаты (Рис. 41). Таким образом,разница в длине связана именно с различиями в скорости агрегациисоответствующих белков. Этот феномен может быть связан как с эффектом самихаминокислотных замен, так и с формированием специфических конформаций,способствующих более эффективной агрегации белка. В случае Sup35NM-M4p,скорее всего, имеет место именно второй механизм, поскольку в экспериментахin vivo мутация sup35-M4 приводила к формированию нового варианта [PSI+],свойства которого сохранялись и после замены мутации на аллель дикого типа.Результаты, полученные для белка Sup35NM-M1p, хорошо согласуются с нашимпредположением, что in vivo агрегация этого белка затруднена в отсутствие белкадикого типа.
Фибриллы Sup35NM-M2p также достоверно короче по сравнению сконтрольным вариантом (Рис. 41). Таким образом, можно предположить, чтопервые два олигопептидных повтора играют важную роль в процессеформирования агрегатов Sup35p, поскольку локализованные в них мутацииsup35KK снижают эффективность этого процесса in vitro.Рисунок 41. Фибриллы, образованные различными Sup35NMp, отличаются по длине. Ввиде «ящиков с усами» (boxplot) представлены распределения значений длин фибрилл,образованных различными Sup35NMp. Достоверные отличия по сравнению с белком дикоготипа, рассчитанные с помощью теста Вилкоксона, отмечены «*» ( * - p < 0,05, *** - p < 0,001).927. ОБСУЖДЕНИЕВ ходе работы мы описали эффекты пяти мутаций, которые содержатдвойные замены соседних полярных незаряженных аминокислотных остатков назаряженные.
Каждая из мутаций локализуется в одном из пяти олигопептидныхповторов N-домена Sup35p. Разработанная система аллелей позволила намвыделить фрагмент белка, вовлеченный в формирование супер-складчатойβ-структуры. Мутации, такие как sup35KK, в этом регионе приводят кдестабилизации всей структуры и потере фактора [PSI+].
Две из исследованныхнами мутаций, sup35-M1 и sup35-M2, обладают таким эффектом при заменеаллели SUP35 дикого типа на sup35KK (Рис. 15). Остальные три мутации способныподдерживать прион, но в разной степени меняют его свойства. Мыпредположили, что для варианта [PSI+], исследованного в ходе работы (штаммдрожжей 10-7A-D832), C-терминальная граница участка, необходимого дляподдержаниясупер-складчатойбета-структуры,локализуетсямежду63-им и 69-ым аминокислотными остатками Sup35p.Обнаруженные эффекты мутаций sup35KK не связаны с изменениемстабильности соответствующего белка (Рис. 16) или с их собственнымфенотипическим проявлением (Рис.
13). Потеря приона в присутствии sup35-M1 иsup35-M2 не связана с неспособностью этих аллелей индуцировать [PSI+](Рис. 20). Кроме этого, мутантные белки могут образовывать агрегаты in vitro(Рис. 38,39). Все эти факты свидетельствуют о том, что эффекты мутацийsup35-M1 и sup35-M2 связаны именно с их влиянием на структуру агрегатов,результатом которого является потеря [PSI+].Факторы [PSI+] и [PIN+] связаны друг с другом. Прион [PIN+] необходим дляпоявления [PSI+] de novo (Derkatch et al., 1997), а точечные мутации или делеции вгене RNQ1 оказывают влияние на поддержание [PSI+] (Kurahashi et al., 2009;Kurahashi et al., 2011).
Тем не менее, описанные эффекты sup35KK не связаны cнарушением взаимодействия [PSI+] и [PIN+] (Рис. 35).Важно отметить, что все описанные эффекты sup35KK характерны для93конкретного варианта [PSI+]. При исследовании других штаммов приона мыобнаружили, что полученные нами мутации оказывают различное влияние насвойства различных вариантов [PSI+] (Рис. 15). Это закономерно, посколькуварианты [PSI+] отличаются по структурной организации агрегатов Sup35p(Toyama et al., 2007; Chang et al., 2008).
И известно, что многие мутации в SUP35,влияющие на стабильность [PSI+], являются «вариант-специфичными» (Derkatchet al., 1999; King, 2001).7.1. Влияние мутаций sup35-M1 и sup35-M2 на стабильность [PSI+]Полученные данные позволяют предположить несколько причин потериприона [PSI+] в присутствии мутаций sup35KK. Это предположение основываетсяна отличиях в эффектах мутаций sup35-M1 и sup35-M2. Из них только мутацияsup35-M2 дестабилизирует прион в присутствии копии гена дикого типа (Рис. 11),а также с высокой частотой приводит к потере приона (Рис. 17). С другойстороны, обе эти мутации не могут поддерживать исследованный вариант [PSI+](Рис. 15,17).
Об исчезновении приона в этих случаях свидетельствуютнеобратимая утрата нонсенс-супрессорного фенотипа, которая сохраняется дажепосле замены мутации на ген SUP35 дикого типа (Рис. 15), а также отсутствиеагрегатов Sup35p (Рис. 18).Исчезновение [PSI+] под действием sup35-M1, судя по всему, вызванонеспособностью Sup35-M1p формировать гомоагрегаты, но это характерно толькодля исследованного варианта приона. В пользу этой гипотезы говорит отсутствиевлияния мутации на стабильность [PSI+] в присутствии аллели дикого типа(Рис.
11,15,17), а также то, что при этом Sup35-M1p включается в агрегаты белкадикого типа (Рис. 19). Наше предположение согласуется и с литературнымиданными, согласно которым 47 и 48 аминокислотные остатки входят в составамилоидогенной последовательности («amyloid stretch») (Chen et al., 2010). Понашим предположениям sup35-M1 поддерживает прион в присутствии SUP35,только потому, что в составе гетероагрегата молекулы Sup35-M1p чередуются сSup35p.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
