Автореферат (1145789), страница 2
Текст из файла (страница 2)
В.И. Ефремовым.Степень достоверности и апробация результатов.Достоверность полученных результатов подтверждается значительным количествомисследованных образцов, повторностью результатов и использованием классических методов5морфологических исследований. По теме диссертации опубликовано 21 печатная работа, из них3 статьи, 1 – статья-материалы конференции, опубликованные в рецензируемых журналах.Основные положения работы докладывались и обсуждались на II Всероссийской конференции смеждународным участием к 105-летию со дня рождения академика А.В. Иванова (СанктПетербург, 2011), Всероссийской конференции с международным участием «Эмбриональноеразвитие, морфогенез и эволюция» (Санкт-Петербург, 2013), III, IV и V Конференции молодыхученых Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 2012, 2014 и 2016), международнойконференции «Heart of Europe: Zebrafish Meeting» (Варшава, 2014), конференции «Современныерешения для исследования природных, синтетических и биологических материалов» (СанктПетербург, 2014); конференции «Морфогенез в индивидуальном и историческом развитии:устойчивость и вариабельность» (Москва, 2015), международной конференции «EMBOWorkshop Embryonic-Extraembryonic Interfaces: Emphasis on Molecular Control of EmbryonicDevelopment in Amniotes» (Гёттинген, 2015), конференции с международным участием«Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии» (Москва, 2016 г.), I СтуденческойНаучной сессии УНБ "Беломорская" СПбГУ (Санкт-Петербург, 2017 г.), международнойконференции «Лососевые рыбы.
Биология, охрана и воспроизводство» (Петрозаводск, 2017 г.),международной конференции «Современные проблемы биологической эволюции» (Москва,2017 г.), конференции «Морфогенез в индивидуальном и историческом развитии: онтогенез иформирование биологического разнообразия» (Москва, 2017 г.). Данные этой работы вошли влекцию, прочитанную на Школе для молодых специалистов и студентов с международнымучастием «Современные проблемы эволюционной морфологии животных» (Санкт-Петербург,2016 г.) Также результаты работы были опубликованы в сборнике тезисов Санкт-ПетербургскойАссамблеи молодых ученых и специалистов (Санкт-Петербург, 2014 г.) и сборнике материаловсовещания «Биология и фундаментальная медицина в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург,2016 г.).Структура и объем диссертации.Диссертация изложена на 137 страницах, состоит из введения, обзора литературы,описания материалов и методов исследования, результатов, обсуждения, заключения, выводов исписка использованной литературы, включающего 363 источника.
Работа иллюстрирована 41рисунком и 3 таблицами.ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫОбзор литературы.В этой главе изложена история исследования ЖСС костистых рыб, охарактеризованыобразование ЖСС в онтогенезе, особенности ядер, его структура и функции. Проанализированвопрос об эволюционном происхождении ЖСС. Рассмотрены аналоги ЖСС костистых рыб,разнообразие и общие характеристики ассимилирующих желток систем.Материалы и методыРабота проводилась, главным образом, на кафедре Эмбриологии Биологическогофакультета СПбГУ, однако некоторые её этапы были выполнены в лаборатории Онтогенеза,Лаборатории Ихтиологии кафедры Ихтиологии и Гидробиологии Биологического факультетаСПбГУ, в ресурсных центрах СПбГУ «Хромас» и «Развитие молекулярных и клеточныхтехнологий» (РМиКТ).Получение материалаDanio rerio.
Зародыши и личинки развивались при температуре 28,5°С. Гистологическимиметодами было изучено 20 стадий эмбрионального развития (Kimmel et al., 1995) и личинки ввозрасте 3-8 дней после оплодотворения (n=290). Для исследования ультраструктуры ЖССфиксировали личинок данио-рерио в возрасте 3-6 суток п/о (n=6).Cyprinus carpio koi. Развитие икры и личинок шло при температуре 23-26°С.
Личинокфиксировали в возрасте 4-6 суток после оплодотворения один-два раза в сутки (n=26).6Misgurnus fossilis. Икра обыкновенного вьюна была получена и зафиксирована И.В. Неклюдовойи сотрудниками на кафедре Эмбриологии Биологического факультета МГУ. Зародыширазвивались при температуре 19-20° С. Материал фиксировали на 13 последовательных стадияхэмбрионального и личиночного развития (Костомарова, 1975), (n=94).Coregonus peled, Coregonus muksun, Coregonus nasus и Stenodus leucichthys nelma. Зародыши иличинки сиговых рыб были получены в рыбоводном хозяйстве на озере Суходольском(Ленинградская область).
Был использован материал из трех партий икры. Инкубациюпроводили в аппаратах Вейса. В 2015 году температура инкубации составляла от 0,7 до 2,8 ºС. В2013 и 2016 году основной период инкубации проходил при температуре 0,2 ºС. В 2014 годуличинок муксуна (n=10), чира (n=12) и нельмы (n=14) фиксировали дважды с интервалом в 10суток. Личинки пеляди (n=14) были зафиксированы в день вылупления и 8 суток спустя. В 201516 годах были получены зародыши (n=12) и личинки (n=2) муксуна.Gasterosteus aculeatus. Икра трехиглой колюшки была собрана В.В. Козиным в окрестностяхМБС СПбГУ в конце июня, начале июля 2015 г. Икра и личинки развивались при температуре10-18 ºС. Фиксировали поздних зародышей (со стадии 22 (Swarup, 1958)) и личинок (n = 12).Гистологическое исследованиеМатериал фиксировали в жидкостях Буэна или Бродского (личинки сиговых),обезвоживали и заливали в парапласт (Paraplast) по стандартной схеме.
Серийные срезытолщиной 5-7 μm получали при помощи санных микротомов. Срезы окрашивали железнымгематоксилином по Гейденгайну или гематоксилином Караччи с докраской эритрозином илиэозином. Препараты фотографировали в РЦ “Хромас” СПбГУ посредством микроскопа LeicaDMPXA, оснащенного цифровой камерой Leica DC 500, либо в РЦ РМиКТ с помощьюмикроскопа Leica DMI6000, либо использовали микроскоп LeicaDM2500, оснащенный цифровойкамерой Nikon DS-Fi1. Для обработки изображений применяли программу Adobe Photoshop 7.0.Трансмиссионная электронная микроскопияБыло использовано две схемы фиксации раствором глутарового альдегида.
Дляпостфиксации использовали 1% раствор OsO4. Пришли к заключению, что фиксация 2-2,5%глутаровым альдегидом при температуре 4ºС предпочтительней (Кондакова, Ефремов, 2014).Материал дегидратировали и заливали в эпон-аралдит. Полутонкие срезы окрашивалитолуидиновым синим или метиленовым синим. Ультратонкие (70-80 нм) срезы контрастировалиуранилацетатом и цитратом свинца. Ультратонкие срезы изучали и фотографировали спомощью электронных микроскопов JEOL JEM 1400 и JEOL JEM 2100.МорфометрияСагиттальные и парасагиттальные срезы фотографировали при помощи микроскоповLeica DMI6000 и Leica DM4000 в РЦ РМиКТ СПбГУ.
Для измерений использовали программыLeica LAS Core и Fiji (Schindelin et al., 2012). Диаметр или длину ядер ЖСС и диплоидных ядеризмеряли на стадиях гаструлы и личинки (29-84 ядер ЖСС, 29-50 диплоидных ядер на зародышаили личинку). Все данные представлены как среднее±стандартная ошибка среднего. Различиямежду дорсальной и вентральной областями ЖСС гаструл, а также длинами ядер ЖСС гаструл иличинок муксуна оценивали при помощи критерия Манна-Уитни. Уровень значимости: P < 0.05.Результаты и обсуждениеУльтраструктура ЖСС Danio rerioЖСС личинок данио-рерио несет на своей наружной поверхности микроворсинки,удлиняющиеся в ходе развития.
Микроворсинки апикальной поверхности ЖСС характерны длявсех изученных видов костистых рыб (Jaroszewska, Dabrowski, 2009, 2011). У данио-рерио ввозрасте 3 суток после оплодотворения микроворсинки длиннее и гуще расположены в областикювьеровых протоков, нежели в тех латеральных участках ЖСС, где контакта с сосудами нет.Распределение органелл ЖСС данио-рерио сходно вдоль дорсо-вентральной и переднезаднейосей. Для него не характерна стратификация по распределению органелл: шЭПР и митохондриирасположены повсеместно, однако большинство митохондрий занимает апикальную часть ЖСС7(Рисунок 1).
ЖСС данио-рерио содержит гетерогенные включения, окруженныеконцентрическими двойными мембранами, представляющие собой остатки желточныхвключений. Гликоген сконцентрирован преимущественно в базальной части ЖСС.Рисунок 1. - Ультраструктура ЖСС личинок данио-рерио.Поперечные срезы. ТЭМ. (А) 4 сут. п/о. Митохондрииразличной формы и шЭПР распределены по всей толщинеЖСС. Лопастное ядро. (Б) 5 сут. п/о. ЖСС во время активногоусвоения желтка. Микроворсинки длиннее, ЖСС содержитбольше желточных включений, чем у личинок более раннеговозраста. Ядро сложной формы. жв - желточное включение; мв- микроворсинки; мх - митохондрия; пж - пластинка желтка; эп–экзоцитозныйпузырек;эпршероховатыйэндоплазматический ретикулюм; я - ядро ЖСС.Черты организации ЖСС, общие для всех изученных видовЖСС представителей всех изученных в нашей работе видов свойственна структурнаярегионализация, связанная, в том числе, с различной интенсивностью процессов ассимиляциижелтка в разных областях и взаимодействием с прилежащими структурами (Рисунок 2), о чемсвидетельствуют отличия по количеству желточных включений, густоте расположениямикроворсинок ЖСС (данио-рерио), а также большое количество включений со слабоокрашенным содержимым в передней, задней и дорсальной областях ЖСС (карп).
В ЖССличинок сиговых и, в меньшей степени, поздних зародышей трехиглой колюшки, цитоплазмавокруг жировой капли выглядит исчерченной (Рисунок 2А, 2В). У сиговых цитоплазма,окружающая желток, различимо подразделяется на две-три зоны (Рисунок 2 Б, 2 Г). ТолщинаЖСС вдоль дорсо-вентральной и переднезадней оси неодинакова на каждой исследованнойстадии и меняется в ходе развития.На стадиях бластулы и гаструлы у данио-рерио и обыкновенного вьюна происходитпоследовательное увеличение размеров ядер (Рисунок 3), что соотносится с данными литературыоб увеличении плоидности ядер ЖСС.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
