Автореферат (1145741), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Приэтом во главу ставилась именно проблема ранней спецификации, паттернирования иморфогенеза мезодермы, а не анализ возможных молекулярных детерминантов и ихактивность на разнообразных стадиях онтогенеза. Выявленные нами принципиальноновые для Spiralia закономерности активности некоторых генов интереса и МАРКсигналинга интерпретируются в сравнительном и эволюционном аспектах на основеаналитическогосопоставленияисчерпывающейподборкилитературныхисточников. Достигнутый нами прогресс в методическом совершенствованииприжизненных и функциональных подходов к изучению регуляции развитиямезодермы у P.
dumerilii является нашим новым и весьма востребованнымрезультатом.5Теоретическая и практическая значимость работы. Полученныерезультаты важны для понимания молекулярного профиля мезодермы у спиральныхживотных, путей приобретения мезодермальной идентичности и морфогенеза этогозачатка. Определение консервативных универсальных механизмов развитияпозволяет реконструировать общего предка анализируемых групп.
Сравнениевыявленных у нереид закономерностей с другими представителями первично- ивторичноротых делает возможным воссоздать облик Urbilateria – гипотетическогопредка всех трехслойных животных. Сделанные нами обобщения по этому поводупозволяют с большей надежностью различать плезиоморфные (древние) иапоморфные (продвинутые) признаки, а также описывать эволюционные события науровне изменения активности генов и искать причины закрепления такихрегуляторных состояний.С практической точки зрения чрезвычайно ценны подобранные иусовершенствованные методы молекулярно-генетических манипуляций нанереидах.
Дальнейшие работы с применением трансгенеза и мутационного анализа,безусловно, будут более продуктивны с учетом представленных наработок.Последовательности впервые клонированных для A. virens и P. dumerilii геновзагружены в базы данных, доступные для научного сообщества, и могут бытьиспользованы для дальнейшего анализа молекулярной эволюции семействсоответствующих генов. Результаты исследования используются в учебномпроцессе на биологическом факультете СПбГУ.
Изложенные и опубликованныеданные включены в лекционные курсы по эволюционной биологии развития иэмбриологии. Препараты экспрессии генов служат методическим материалом напрактическихзанятиях,демонстрирующихмолекулярнуюприродудифференцировки мезодермы и генетическую обусловленность процессов развития.Методология и методы исследования. Был применен как описательный, таки экспериментальный подход. Наблюдения проводили на живом и фиксированномматериале развития. Для этого по протоколу искусственного оплодотворенияполучали синхронные эмбриональные культуры Alitta virens (от производителейдикого типа) и Platynereis dumerilii (от животных дикого типа, а также из инбредныхи трансгенных линий). В зиготы P.
dumerilii с помощью микроинъекций доставлялиразличные мРНК и ДНК. При фиксации стадий развития использовали сотниобъектов. Выявление специфических эндогенных белков и мРНК в клеткахзародышей и личинок проводили на тотальных препаратах по протоколуиммуноцитохимии и молекулярной гибридизации in situ (whole mount in situhybridisation, WMISH).Среди молекулярно-биологических методик использовали: выделение мРНК,обратную транскрипцию, клонирование генов, рестрикционный анализ, блоттинг игибридизацию по Саузерну, транскрипцию in vitro, конструирование репортерныхтрансгенов и сайт-специфических нуклеаз TALEN, рекомбинацию бактериальныхискусственных хромосом (ВАС), проверку активности транспозазы в клеткахзародышей. Среди различных вариантов полимеразной цепной реакции (ПЦР) былиПЦР со специфическими праймерами на кДНК и гДНК, вырожденная ПЦР,гнездовая ПЦР, тачдаун-ПЦР (touchdown PCR), RACE-ПЦР, полуколичественнаяПЦР с обратной транскрипцией RT-ПЦР (ОТ-ПЦР), TAIL-ПЦР (Thermal Asymmetric6Interlaced PCR).
Широкое применение получили методы анализа in silico, включаямоделирование филогенетических схем, предсказание структуры генетическихлокусов, аннотирование последовательностей мРНК и белков.Для оценки значимости молекулярных факторов применяли методологию“утрата функции” (loss-of-function). МАР-киназный сигналинг подавлялифармакологическим агентом U0126. Нокаут гена Pdu-twist проводили с помощьюTALEN-индуцированного мутагенеза.Положения, выносимые на защиту1.
В геномах нереид A. virens и P. dumerilii присутствуют консервативные дляSpiralia мезодермальные регуляторные факторы – гомологи генов Twist, Mox, Evx,Vasa, PL10, Piwi.2. Эти факторы дифференциально экспрессируются в ходе эмбрионального иличиночного развития A. virens, придавая мезодермальным клеткам уникальноерегуляторное состояние.3.
На стадиях дробления у нереид выявлены активные компоненты МАР-киназногосигнального пути, которые важны для морфогенеза мезодермальных полосок.4. Впервые опробованные на P. dumerilii генетические методы (трансгенез имутагенез) и сформулированные методические рекомендации открываюткачественно новые возможности исследования мезодермы у Spiralia.Степень достоверности и апробация результатов. Результаты и выводыработы имеют высокую степень достоверности, поскольку получены с помощьюкомплекса разных методов на двух объектах с применением повторностей,контролей и статистической обработки.
Журнальные публикации автора прошлитщательное рецензирование и активно цитируются. Полученные данныеопубликованы в 12 работах. Из них 4 статьи в специализированных изданиях,рекомендованных ВАК и индексируемых WoSCC и Scopus, в том числе 3 наанглийском языке, и 8 тезисов конференций. Автором работы были сделаны устныедоклады на III Конференции молодых ученых Института цитологии РАН (СанктПетербург, 2012 г.), на Всероссийской конференции с международным участием“Эмбриональное развитие, морфогенез и эволюция” (Санкт-Петербург, 2013 г.), наМеждународном V съезде Европейского Общества Эволюционной БиологииРазвития (Вена, Австрия, 2014 г.), на Всероссийской конференции “Морфогенез виндивидуальном и историческом развитии: устойчивость и вариабельность”(Москва, 2015 г.), на III Всероссийской конференции с международным участием“Современные проблемы эволюционной морфологии животных” (Санкт-Петербург,2016 г.), а также на научных семинарах кафедр эмбриологии и зоологиибеспозвоночных биологического факультета СПбГУ.
Стендовые докладыпредставлялись на Международной конференции “Современные методымикроскопии в биологии и медицине” (Санкт-Петербург, 2009 г.), наМеждународной конференции “Каспар Фридрих Вольф и современная биологияразвития” (Санкт-Петербург, 2009 г.), на Международном IV съезде ЕвропейскогоОбщества Эволюционной Биологии Развития (Лиссабон, Португалия, 2012 г.).Объем и структура работы. Диссертация изложена на 189 страницах исостоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы, который включает341 источник. Рукопись содержит 58 рисунков и 3 таблицы.7ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫОбзор литературы. В данной главе изложены классические представления омеханизмах развития и современное состояние проблемы формирования мезодермыв онтогенезе и эволюции. Проанализированы молекулярные механизмы миогеннойдифференцировки и роль консервативных регуляторных генов.
Охарактеризованыважнейшие аспекты развития мезодермы у Spiralia и биологии нереидных полихет.Материалы и методы. Эмбриональные культуры A. virens и P. dumeriliiполучали в полевых (на МБС СПбГУ) и лабораторных условиях (на каф.эмбриологии СПбГУ и в МФПЛ Университета Вены). Из зародышей различныхстадий (время развития приводится в часах после оплодотворения – чпо) выделялимРНК и гДНК. Из мРНК с помощью обратной транскрипции получали кДНК. Избиблиотек кДНК в различных вариантах ПЦР (вырожденная ПЦР, RACE-ПЦР и др.)амплифицировали фрагменты генов интереса и клонировали их в вектор.
Некоторыефрагменты гомологов Twist, Evx, Vasa, PL10 и Piwi у A. virens были получены отР.П. Костюченко. С помощью транскрипции in vitro на клонированных фрагментахполучали меченые дигоксигенином антисмысловые РНК-зонды. Их использовали вгибридизации in situ на тотальных препаратах (WMISH), позволяющей выявить узафиксированных объектов домены экспрессии генов интереса (т.е.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
