Автореферат (1145741), страница 5
Текст из файла (страница 5)
Нам удалосьвыявить как минимум два периода неравномерного распределения киназы dpErk1/2во время дробления (на четвертом и шестом–седьмом клеточном цикле). Навосьмиклеточной стадии (завершение четвертого клеточного цикла) ядерный сигналdpErk1/2 приурочен к дорсальным бластомерам 1с, 1d и 1D (Рис. 6А).
На стадии 16бластомеров dpErk1/2 выявлена во всех 12-ти микромерах, но отсутствует вмакромерах (Рис. 6Б). Второй период с выраженной дорсовентральной полярностью15в распределении активной формы Erk1/2 наступает со стадии 17 бластомеров (последеления макромера 2D на 3d и 3D и начала шестого клеточного цикла). В это времяактивная форма МАР-киназы присутствует во всех интерфазных ядрах, но необнаруживается у делящихся клеток (Рис.
6В, Г). 3D долгое время остаетсяединственным макромером с активированным каскадом МАРК. Это сближаетпаттерны активности МАРК у зародышей A. virens и всех исследованныхмоллюсков. Таким образом, почти универсальная для спиралий активация МАРкиназного сигналинга в макромере 3D, что неразрывно связано с запускомэмбрионального организатора у моллюсков, представляет собой консервативнуючерту спецификации этой мезэнтодермальной клетки-предшественника. Наличиеболее раннего периода активности МАРК у A. virens можно интерпретировать какакселерацию определения квадранта D при гетероквадрантном спиральномдроблении.
На завершающих этапах дробления лишь очень слабый сигнал dpErk1/2выявляется в ядрах потомков соматобластов – М-клетках, 2d11, а также в некоторыханимальных микромерах (Рис. 6Д).Рис. 6. Распределение активной формы МАР-киназы в ходе дробления у A. virens.Иммуноцитохимическое выявление dpErk1/2 (зеленый канал), тубулина (красный) и окраска DAPIна ДНК (синий), максимальная проекция конфокального Z-стека.
Д–Д ’’ – вид с вегетативногополюса, дорсальная сторона справа; остальные – вид с анимального полюса, дорсальная сторонавнизу. В каждом вертикальном столбце (A–A’’, Б–Б’’, B–B’’, Г–Г’’, Д–Д’’) представлен один и тотже зародыш, стадия развития указана сверху. Разные каналы показаны в вертикальных рядах: А–Д– антитела к dpErk1/2 (вместе с антителами к тубулину в Д–Д’’); А’–Д’ – DAPI; А’’–Д’’ –совмещение всех каналов. Бластомеры с сигналом dpErk1/2 подписаны на А–Д;идентифицированные клетки, не проявляющие иммунореактивность к dpErk1/2, подчеркнуты наД, А’–Г’.
Стрелка указывает на полярные тельца (анимальный полюс). Масштаб 50 мкм.Ингибиторный анализ обнаружил критические периоды действия МАРК унереид во время дробления. У A. virens наибольший эффект наблюдался при16воздействии ингибитора U0126 до формирования соматобласта 4d. Такоеподавление МАРК оказало отсроченный эффект на морфогенез МП, причеммолекулярные признаки спецификации и паттернирования энтомезодермы не былиутрачены, т.к. мы наблюдали экспрессию Avi-twist и Avi-mox. Сходные нарушенияорганизации МП были отмечены и у P.
dumerilii (Козин, Костюченко, 2009). Уличинок A. virens из экспериментов, начатых на стадии 8 бластомеров (I), 16бластомеров (II) и 17 бластомеров (III) строение и форма МП была существеннонарушена. Вместо нормального метамерного паттерна экспрессии Avi-twist и Avimox на вегетативном полюсе трохофор наблюдались домены экспрессии в плотныхклеточных конгломератах или в деформированных МП, сильно укороченных вдольпереднезадней оси (Рис.
7). У трохофор из эксперимента (IV), в котором ингибиторU0126 применялся после деления бластомера 3D, видимых отличий в экспрессииAvi-twist и Avi-mox по сравнению с контролем отмечено не было.Рис.7.Сравнениедлинымезодермальных полосок у трохофор A.virens в норме и после воздействияингибитором U0126. Показано среднеезначение длины МП (n=18) у объектов изэкспериментов (I), (II), (III), (IV) и вконтроле (подписано на оси абсцисс).
Вкачестве планок погрешности приведенызначения 95% доверительного интервала.Звездочкойобозначенодостоверноеотличие от контроля.Теоретически можно предположить, что МАР-киназный сигналинг у нереид 1)участвует в паттернировании всего зародыша, что необходимо для инструктивнойрегуляции морфогенеза МП извне или 2) обеспечивает определенные компетенциисамой энтомезодермы.
По нашему мнению более вероятен второй сценарий,поскольку энтомезодерма нереид сегрегируется от макромеров линии D в рядуделений клеток 1D, 2D, и, наконец, 3D. С этим согласуется, что 1D и 3D являютсяединственными макромерами с ранней активностью Erk1/2. У хордовых МАРКзависимый FGF сигналинг имеет консервативную функцию непосредственнойспецификации презумптивной мезодермы (Kim, Nishida, 2001; Böttcher, Niehrs, 2005;Green et al., 2013). Есть основания полагать, что МАРК у ряда моллюсков такжеявляется медиатором зависимой спецификации мезэнтодермального бластомера 3D(Lambert, Nagy, 2003). Таким образом, предполагаемая нами многократнаяактивация МАРК у нереид связана с поэтапной детерминацией энтомезодермы. Приэтом впервые показано, что МАРК на стадиях дробления отвечает загаструляционный морфогенез мезодермы, но не предопределяет образованиемезодермального зачатка и его молекулярную разметку.Выводы1.
Avi-twist и Avi-mox являются наиболее тканеспецифичными из известных раннихмаркеров мезодермальных клеток у зародышей и личинок A. virens. Экспрессияэтих генов в энтомезодерме имеет метамерный характер, что, вместе с172.3.4.5.6.7.циркумбластопоральной активностью Avi-twist во время гаструляции, являетсяэволюционно древней чертой развития мезодермы.Гены Avi-vasa, Avi-pl10, Avi-piwi1 и Avi-piwi2 дифференциально экспрессируютсяв клетках разных зародышевых листков, вовлеченных в активныеморфогенетические процессы. Наиболее интенсивная и продолжительнаяэкспрессия в тканях мезодермальной природы указывает на ихмалодифференцированное состояние вплоть до продвинутых личиночныхстадий.Картина сложного сочетания доменов экспрессии Avi-twist, Avi-mox, Avi-evx, Avivasa, Avi-pl10, Avi-piwi1, Avi-piwi2 отражает раннюю гетерогенностьнедифференцированных мезодермальных полосок.
Такой молекулярныйпрофиль может служить основой для дальнейшей сегрегации мезодермальныхпроизводных.Во время дробления МАР-киназный сигналинг у A. virens необходим дляреализации нормального морфогенеза энтомезодермы, но не детерминирует ееспецификацию и паттернирование.Структурно-функциональная организация и филогенетическое положениегомологов генов Twist, Mox, Evx, Vasa, PL10, Piwi у A. virens и P. dumeriliiсвидетельствует о малой степени дивергенции их последовательностей исохранении анцестральных черт в генетическом аппарате нереид.Доставка искусственных генетических репортерных конструкций в геном P.dumerilii с помощью транспозона Mos1 малоэффективна, поскольку вырезаниетрансгена из донорного вектора и его встраивание в гДНК клеток зародышаосуществляется в неканонической нерегулярной манере.Трансгенез на основе рекомбинантных BAC и мутагенез посредством сайтспецифических нуклеаз TALEN являются перспективными методамиприжизненного и функционального анализа регуляторов развития нереид (вчастности мезодермального фактора Twist).СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ1.2.3.4.Статьи и тезисы в журналах, рекомендованных ВАК:Козин В.В., Костюченко Р.П.
Эволюционный консерватизм и вариабельностьразвития мезодермы у Spiralia: неповторимый паттерн нереидных полихет //Известия РАН. Серия биологическая. 2016. № 3. С. 265–275.Козин В.В., Костюченко Р.П. Свидетельства мультипотентного состояния клетокзоны роста полихеты Nereis virens // Цитология. 2012. Т. 54. № 4. С. 342–343.Kozin V.V., Filimonova D.A., Kupriashova E.E., Kostyuchenko R.P. Mesodermpatterning and morphogenesis in the polychaete Alitta virens (Spiralia, Annelida):Expression of mesodermal markers Twist, Mox, Evx and functional role for MAPkinase signaling // Mech. Dev. 2016. V.
140. P. 1–11.Kozin V.V., Kostyuchenko R.P. Vasa, PL10, and Piwi gene expression during caudalregeneration of the polychaete annelid Alitta virens // Dev. Genes Evol. 2015. V. 225.№ 3. P. 129–138.185. Backfisch B., Kozin V.V., Kirchmaier S., Tessmar-Raible K., Raible F. Tools forgene-regulatory analyses in the marine annelid Platynereis dumerilii // PLoS ONE.2014.
V. 9. № 4. P. e93076.1.2.3.4.5.6.7.Тезисы в материалах конференций:Козин В.В., Гук Д.В., Филиппова Н.А., Костюченко Р.П. Спецификация идифференциация мезодермы у нереидных полихет (Spiralia, Annelida) //Материалы конференции “Современные проблемы эволюционной морфологииживотных”. Санкт-Петербург, 2016. С. 60–61.Козин B.B., Филимонова Д.А., Костюченко Р.П. Морфогенетические процессыразвития мезодермы у Spiralia: эволюционный консерватизм и вариации //Конференция “Морфогенез в индивидуальном и историческом развитии:устойчивость и вариабельность”. Тезисы.
Москва, 2015. С. 28–29.Козин В.В. Современный этап в изучении развития и репродукции нереидныхполихет – создание трансгенных и нокаутированных животных // Конференция“Эмбриональное развитие, морфогенез и эволюция”. Тезисы. Изд-во ВВМ,Санкт-Петербург, 2013. С. 63–64.Козин В.В., Костюченко Р.П. Формирование личиночной мезодермы у Nereisvirens и Platynereis dumerilii (Polychaeta, Annelida) // Конференция “КаспарФридрих Вольф и современная биология развития”. Тезисы. Санкт-Петербург,2009.
С. 39–42.Kozin V.V., Raible F., Kostyuchenko R.P. Designing a mesodermal molecular toolkitin the marine annelids Alitta virens and Platynereis dumerilii // EURO EVO DEVO22–25 July 2014. Vienna, 2014. P. 254–255.Kozin V.V., Kostyuchenko R.P. MAP kinase signaling in cell fate and dorsoventralaxis specification during Spiralia embryogenesis // Euro Evo Devo Lisbon 2012 July10-13 Abstract Book. Lisbon, 2012. P. 194.Kozin V.V., Kostyuchenko R.P. Mesoderm formation in the polychaete Nereis virens// International conference “Modern Microscopy Techniques in Biology andMedicine”. Saint-Petersburg, 2009.
P. 15.19.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
