Автореферат (1145732), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Подсчетчисленности микробных клеток проводили методом проточной цитофлуорометриис использованием красителя SYBR Green-I и прибора BD FACSAria, как описаноранее (Alekhina et al., 2007). По причине высокой вероятности загрязнения образцовчужеродной ДНК применялись соответствующие этапы деконтаминации,описанные ранее (Petit et al., 2005).Пробы воды из четырех глубин высевали на стандартную агаризованную средуR2A (“Difco”), разведенную в 100 раз. Посевы инкубировали в холодильнике при4 оС в течение двух месяцев. Выросшие колонии рассевали, и из отдельных клоновбыла экстрагирована геномная ДНК (гДНК) согласно протоколу производителя(“Qiagen”, Германия). Для амплификации ПГ 16S рРНК использовалибактериальные универсальные праймеры 1492R (Eden et al., 1991) и w001mCFm(Godon et al., 1997).
Полученные ПЦР-продукты для проверки гомогенностипопуляции были риботипированы с помощью двух эндонуклеаз рестрикции AluI иHaeIII (“SibEnzyme”, Россия). Выявленные гетерогенные (смесь видов) культурыклонировали и полученные клоны-представители секвенировали.Для выделения гДНК использовали прибор FastPrep (“MPBiomedicals”, США) икоммерческий набор PowerSoil DNA isolation kit (“MoBio Labs”, США).
В качествеконтроля проводили экстракцию гДНК без добавления материала. Дляамплификации области v3–v5 (590 п. о.) и ПГ 16S рРНК использовали парубактериальных универсальных праймеров 338F/Com2-905Rm и 1492R/w001соответственно, как описано ранее (Bulat et al., 2004; Lavire et al., 2006).Амплификацию области v4–v8 (890 и 893 п. о.) генов 16S рРНК проводили6с использованием бактериальных вырожденных универсальных праймеров 515mFи двух частично перекрывающихся «обратных» праймеров 1397mR и 1391mR.Во всех случаях параллельно с опытной ставили контрольную реакцию(негативную ПЦР) с использованием воды Ambion (США) в качестве материала.Продукты ПЦР-реакций анализировали методом электрофореза в 1,6 %-номагарозном геле в буфере 0,5хTBE с окрашиванием SYBR Gold (США) для большейчувствительности.Молекулярное клонирование проводили с использованием TOPO TA Cloning Kitfor Sequencing и химически компетентных клеток Escherichia coli согласнопротоколу компании “Invitrogen” (США).
Наличие вставки в вектор определялиметодом ПЦР с праймерами Bul1 и Bul2. Для предварительного определениястепени разнообразия клоновых библиотек использовали метод риботипирования стремя эндонуклеазами рестрикции: AluI, HpaII и HaeIII (“SibEnzyme”, Россия).Клоны одного рестрикционного профиля объединяли в один риботип.Представители каждого риботипа в количестве от одного до трех клоновсеквенировали по Сэнджеру (“LGC Genomics”, Берлин, Германия).Полученные нуклеотидные последовательности (н. п.) анализировали с помощьюпрограммы Chromas Lite 2.01. Множественное выравнивание и сравнение н. п.проводили, используя программу CLUSTALW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html).
Н. п., показавшие ≥ 98 % сходства, а также одинаковыйперечень в мировой базе GenBank (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), объединяли водин филотип, или ОТЕ (операционная таксономическая единица). Выявленныефилотипы сравнивали сперва с собственной базой контаминантов (БК) (Bulat et al.,2004), содержащей бактериальные филотипы из разного рода контрольных реакций.Идентификацию филотипов проводили при помощи алгоритмов BLAST и RDP(http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp).
Последовательности, показавшие ≤ 90 % сходствас известными таксонами, относили к неидентифицированным филотипам, тогда какфилотипы, которые нельзя было отнести ни к одному из известныхфилогенетических таксонов, определяли как неклассифицируемые. Филотипы,представленные тремя и более клонами в клоновой библиотеке, рассматривали какдоминантные. Филотипы, показавшие ≥ 98 % сходства с ОТЕ, выявленными приизучении микробиоты человека (здорового и больного), были отнесены к HAфилотипам (Human Associated – связанные с человеком), рассматриваемым какконтаминанты человеческого происхождения. Построение филогенетическогодерева проводили методом максимального правдоподобия с помощью программыMEGA6 (Kumar et al., 2008). Выявленные филотипы депонировали в GenBank:JF901736–JF901755, KR811200–KR811209.Оценку достаточности покрытия клоновых библиотек рассчитывали по формулеГуда (Good, 1953), а также путем построения аналитических кривых с помощьюпрограммы aRarefactWin 1.3 (http://strata.uga.edu/software/anRareReadme.html).
Длярасчета индексов Шеннона – Уивера и Чао1 использовали программу DOTUR 1.53(Schloss & Handelsman, 2005).РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕМолекулярно-биологический анализ микробных сообществ образцов водыозера. Всего для изучения четырех горизонтов водного столба озера идополнительного образца истока реки было создано 12 клоновых библиотек ипроанализировано 540 клонов по трем областям генов 16S рРНК (табл.
1).7Таблица 1. Статистические данные для 12 клоновых библиотек, созданных для пяти образцов водыПараметрыВодный столбГлубина1,3 м100 м200 м367 мОбразецR1B17Rf1RR100B R1007 R200B R2007 R367A+B 37R/31RОбласть генаv3–v5v4–v816Sv3–v5v4–v8 v3–v5v4–v8v3–v5v4–v816S рРНКЧисло38/1340/1039/638/840/1341/1439/1488/2060/19клонов/флотиповЧисло «истинных»31/939/938/536/729/929/821/879/1559/18клонов/филотипов*НА-филотипы2011012019,378111122,519,597Индекс Чао1(9,0–(6,0–(7,0–(9,2–(8,3–(16,3–(18,1–(н.
д.)(н. д.)14,9)16,6)17,6)25)30,9)57,5)30,4)2,02,00,71,31,81,91,82,7Индекс Шенонна –2,2(1,7–(1,7–(0,3–(0,9–(1,5–(1,6–(1,5–(2,5–Уивера(1,9–2,3)2,2)2,2)1,1)1,6)2,1)2,1)2,1)2,8)Индекс Гуда, %949795928697819293f3RИсток реки2мR2rR2r216Sv3–v5 v4–v840/1238/1024/939/1124/620/6119(13,3–48,5)1,7(1,3–2,1)8506,1(6,0–19,6)1,5(1,1–1,8)9206,7(6,1–22,0)1,5(1,1–1,8)95* «Истинные» филотипы – филотипы, прошедшие контроль на контаминацию (БК). Табличные индексы рассчитывали только для«истинных» филотипов.8Все клоны были объединены в рибогруппы, представители которых былисеквенированы. Выявленные филотипы были проверены по БК и на статус HAфилотипов. В результате число «истинных» филотипов (прошедших все контролина контаминацию) составило 40, из них 20 филотипов были отнесены кдоминантным. HA-филотипы среди доминантных выявлены не были. Оценкаклеточных концентраций микроорганизмов в образцах воды с четырех глубинпоказала их содержание в интервале (1,6–2,4) · 104 кл/мл, что на порядок ниже, чемв соседнем оз.
Бивер (Laybourn-Parry et al., 2006) и говорит о сравнительно низкойбиомассе.Сравнение двух библиотек 367А и 367В нижнего горизонта по областиv3–v51. Сравнительный анализ двух экспериментальных библиотек (дванезависимых выделения ДНК) показал, что все филумы были общими, кроме классаδ-proteobacteria, представленным филотипом (R6-2), отдаленно родственным (83 %сходства) Desulfomicrobium hypogeium и выявленным только в библиотеке R367A.В обеих библиотеках численным превосходством обладали филотипы филумаActinobacteria (63 % в R367B и 77 % в R367A).
Библиотека R367A былапредставлена пятью ОТЕ, а R367B только тремя ОТЕ, которые оказались общимидля обеих библиотек. Из них два ОТЕ (R6-4/3R-1 и R6-16/3R-16) близкородственныс Candidatus Planktophila limnetica (Actinobacteria). Третий общий филотип(R6-6/3R-41) показал конспецифичность (98,9 % сходства) с Mycobacteriumpyrenivorans. Общими для библиотек также были клоны R6-18 и 3R-4, сходные на98 % Roseomonas frigidaquae, и клоны R6-20 и 3R-12, сходные на 88 %хлоропластной ДНК (хпДНК) зеленой водоросли Pedinomonas minor.В итоге из общего числа филотипов (12 для R367A и 8 для R367B) только пятьбыли представлены в обеих библиотеках. Статистические данные (табл. 2)показывают, что выборка библиотеки R367B была репрезентативна, судя поиндексу Гуда (94 % покрытия), выходу аналитической кривой на плато (рис. 1), атакже индексу Чао1, в то время как выборка библиотеки R367A оказаласьнедостаточно представительной. Таким образом, благодаря тому, что проба А былавзята ближе к осадкам, чем проба В, библиотека R367A показала большееразнообразие.
В итоге обе библиотеки были объединены, а общее число клонов ифилотипов библиотеки R367A/B составило 88 и 15 соответственно.Таблица 2. Статистические данные для четырех экспериментальных библиотекПараметрыГлубинаОбразецОбласть гена 16S рРНКЧисло клонов/флотиповЧисло «истинных» клонов/филотиповИндекс Чао1Индекс Шенонна –УивераИндекс Гуда, %Водный столб367 мR367B31RR367Av3–v548/1540/1044/1235/8178,3(12,8–40,9) (8,0–12,8)1,91,5(1,6–2,2)(1,2–1,9)869437Rv4–v820/520/55(н. д.)1,5(1,2–1,7)9540/1539/1414,6(14,0–21,1)2,5(2,3–2,7)921Образец воды был взят пробоотборником Kemmerer объемом 1,2 л и длиной 47 см. При отборе пробы внижнюю часть пробоотборника попала вода, расположенная ближе к осадкам (проба А), тогда как верхняя частьбыла заполнена более высоким слоем воды (проба В).9Рис.
1. Аналитические кривые, иллюстрирующие зависимость числа филотипов от объемавыборки. Графики приведены для четырех первичных библиотекСравнение двух экспериментальных библиотек 31R и 37R нижнегогоризонта по области v4–v8. Для амплификации участка v4–v8 генов 16S рРНКбыли использованы общий «прямой» праймер и два незначительно различающихся«обратных» праймера, практически одного размера, но со сдвигом попоследовательности ДНК на четыре буквы (на 3’-конце). Необходимо быловыяснить, какая из двух комбинаций праймеров более эффективна в плане«вскрытия» микробного разнообразия.Сравнительный анализ показал, что в библиотеке 31R филотипы относилиськ двум бактериальным филумам и одному эукариотическому отделу, тогда какв библиотеке 37R – четырем и двум соответственно, из которых Actinobacteriaи Bacteroidetes были общими.
На уровне филотипов общей оказалась только однан. п. (клоны 31R-9/37R-2), относящаяся к пресноводным Actinobacteria и сходная на96,5 % с Candidatus P. limnetica. Судя по выходу аналитических кривых на плато,а также по величине показателя Гуда, обе библиотеки оказались достаточнорепрезентативны, индекс видового богатства Чао1 в обоих случаях равнялся числуфилотипов в каждой библиотеке (см. рис. 1, табл. 2).Таким образом, сравнение двух данных библиотек показывает важность дизайнапраймеров для ПЦР, когда сдвиг праймера на четыре буквы на 3’-концекардинально меняет картину выявляемого микробного разнообразия.
В итоге длядальнейшей работы был выбран обратный праймер 1397mR. Впоследствии обебиблиотеки были объединены.Сравнительный анализ трех (v3–v5, v4–v8, ПГ) областей гена 16S рРНК.Сравнительный анализ трех областей показал, что для v3–v5 было выявлено16 филотипов (10 доминантных), v4–v8 – 22 (16), ПГ – 12 (3) (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
