Автореферат (1144793), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Диссертация изложена на 375 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, 4глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка цитированной литературы, включающего163 источников отечественных и 206 зарубежных авторов приложения. Работа иллюстрирована 16 таблицами, 107 рисунком.Основное содержание работыМатериал и методы исследованияМатериалом для исследования морфологической картины биожидкостей являлись: сыворотка крови (СК); ротовая жидкость (РЖ); носовой секрет (НС); смывы со слизистой носа и миндалин (ССН) пациентов с различными видами патологии. При невозможности исследования БЖ непосредственно после получения, образцы маркировали и помещали в стерильныепластиковые пробирки Эппендорфа и сохраняли при температуре −700С.Сыворотка крови.
Кровь для лабораторных исследований бралинатощак из вены в объёме 5-6 мл у больных с различной патологией и здоровых людей (группа сравнения). После образования сгустка пробирку центрифугировали в течение 10 минут при 900g, сыворотку переносили в отдельную пробирку. Весь объем СК делили на 4 равные порции.Ротовая жидкость. РЖ брали стерильной пипеткой из подъязычнойобласти полости рта в утренние часы, натощак, через 30 минут после ополаскивания полости рта дистиллированной водой. РЖ собирали в стериль-9ные пробирки, центрифугировали 15 минут при 900g. Для исследованиябрали надосадочную часть РЖ.Носовой секрет.
Для морфологического изучения структур твердойфазы жидких сред слизистой оболочки носа нами были разработаны специальные способы получения: внеклеточной и внутриклеточной надосадочнойжидкости гомогената клеток слизистой полости носа (Патент РФ №2287161, 2006). Способ получения НС для последующего его морфологического исследования заключается в следующем: материал берётся специальной щеточкой из места его наибольшего скопления в области дна полостиноса, щеточку опускают в пробирку с 0,5 мл физиологического раствораNaCl и тщательно вращают. С целью получения достаточного для исследования количества материала сбор секрета и перенос щёточки в одну и ту жепробирку проводится трижды.
Затем пробирка с материалом для исследования центрифугируется в течение 15 минут при 900g.Смывы со слизистой носа. ССН со слизистой оболочки носа проводили с помощью специально разработанного нами устройства (Патент РФ№2455942, 2010, Патент РФ №2465594, 2011).Объектами наших исследования являлись также: вода и модельныежидкости (МЖ): растворы сывороточного альбумина человека (САЧ) и поваренной соли в заданной концентрации.Методы исследований.
Решение поставленных задач потребовалоиспользование имеющихся и разработки новых подходов и методов вследующих направлениях: методы перевода жидкостей в твёрдую фазу (метод клиновидной дегидратации), морфологический анализ (микроскопия вбелом и поляризованном свете, фазово-контрастная микроскопия), медикобиологическая морфометрия, методы обработки цифровых изображений иодномерных сигналов, методы анализа и распознавание изображений. Обработка цифровых изображений и статистический анализ полученныхрезультатов проводились с использованием программы Mathematica версия11.0 (Wolfram Research).Метод клиновидной дегидратации.
В окна тест-карты комплекта «Литос-система» (ТУ 9398-245-0531637-2007 ФГУ, регистрационное удостоверение № ФСР 2008/02488 от 29 апреля 2008 г.), расположенной строго горизонтально лабораторной пипеткой последовательно наносили капли БЖ вобъеме 20 мкл. Тест-карту помещали в сушильный комплекс ФГУП «ФНПЦ«Прибор». Высушивание производили при температуре 20 – 25 °С и относительной влажности 65%. Продолжительность периода высыхания (домомента анализа структуры) составляла 18 – 24 часа.Исследование структурообразующих элементов дегидратированнойкапли – «фации», проводили с помощью стереомикроскопа Leica MZ12 иБИМАМ Р–13.
Стереомикроскоп MZ12 обладал большой апертурой, апохроматической зум-системой с револьвером на 2 объектива с плоским полем зрения и эргономическим тубусом. Ввод изображений в компьютер10осуществляли через стандартный интерфейс USB с помощью видеонасадкиLeica DFC300 FX. Наблюдение проводились в «светлом» и «темном» полях,как в обычном, так и поляризованном свете.
Видео- и фотоизображения регистрировались и обрабатывались с помощью программного обеспечения,входящего в комплекты поставки аппаратуры. Цифровая камера записывает(вид сверху) области с каплей с частотой кадров 50 кадров в секунду длянаблюдения за динамикой движения контактной линии. Эта частота былаоптимальной для наблюдения за процессом высыхания капли и позволилонам получить изображения 1280×720 пикселей на площади 20.5×11.3 мм2.При исследовании картины течений в высыхающей капле мы использовали также оптический микроскоп БИМАМ Р–13 фирмы ЛОМО с разрешающей способностью 40–600х. В микроскопе БИМАМ Р–13 использовалиручную настройку с видеонасадкой МФН−11, дающей дополнительное увеличение до 2.5×.
Автоматизированный микроскоп Leica MZ16А использовался для определения размера изображения и положения плоскостинаблюдения. В опытах глубина резкости не превышала 0.2 мм, что позволяло последовательно визуализировать картины течений вблизи свободнойповерхности, на полувысоте и около подложки уже в капле высотой около 1мм.Метод телевизионной микроскопии. С его помощью получали сериицифровых изображений (кадров) текстур БЖ в процессе формирования фаций и проводили их качественную оценку.
При анализе сыворотки крови(СК) в обязательном порядке исследованию подвергали два объекта: 1) фацию, полученную из сыворотки свежевзятой крови (исходная фация СК), и2) фацию, полученную из СК, хранившейся в течение суток при температуре 5 0С (суточная фация СК). Видео было записано на диске компьютера, иотдельные кадры анализировали с использованием системы обработкиизображений.Методы компьютерной обработки и анализа изображений структурфаций БЖ.
Анализ морфологической картины фаций БЖ включал следующие структурные параметры: целостность контуров фации, выраженностьцентральной солевой зоны, радиальную симметрию трещин и секторов,наличие отдельностей и конкреций, кольцевые концентрационные структуры, отклонения от нормальной системной организации фации и присутствиев ней локальных патологических образований.При изучении фации БЖ использовали программу обработки и анализа изображений Image Pro Plus 6.0 фирмы Media Cybernetics. В работе такжеиспользовали компьютерную программу Mathematica 11.0, фирмы WolframResearch, с пакетом математической обработки изображений. Исходным материалом для программы служили файлы изображений фаций БЖ. На выходе получали статистические данные распределения морфологических маркеров в фации и на основании их делали выводы о различии структур фацийБЖ. Статистическую обработку фации в норме и при патологии вели в той11же программе по статистическим признакам 2-го порядка с использованиемматрицы вероятностного распределения яркости.Методы математического моделирования процессов структурирования БЖ при клиновидной дегидратации.
Нами создана модель, позволяющаяколичественно оценить отдельные характеристики капель БЖ: их форму,размеры, величину температурного переохлаждения поверхности, оценитьвремя испарения. Проведенные экспериментальные исследования процессавысыхания капель БЖ показали наличие двух режимов клиновидной дегидратации: испарение с фиксированным углом смачивания и с фиксированнойграницей фаз. Первый режим характерен для БЖ (РЖ, слезная жидкость) смалой концентрацией (менее 1% ) растворенных веществ. Второй режимпроявлялся при высыхании СК, мочи, желчи, в которых концентрация растворенных веществ в совокупности может достигать 13 % .
Оба режима рассмотрены в данной работе.Формирование периодических структур исследовалось на базе МЖ,включающих два основных компонента БЖ: растворённый белок и поваренная соль. В опытах проводили видеозапись изображения капли растворастандартного размера (начальный радиус составлял 0.2 см), высыхающейнепосредственно на предметном стекле микроскопа.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
