Диссертация (1144318), страница 6
Текст из файла (страница 6)
3).Графики зависимости значения амплитуды мембранного тока от длительностисветового стимула для одного нейрона приведены в приложении 2.Таблица 3Зависимость амплитуды мембранного тока (пА)от длительности светового стимула при разных интенсивностях светового стимула(данные приведены для одного нейрона)Относительная интенсивностьДлительность (мс)123451020300,12,5±0,5612,6±0,877,6±1,6710,0±1,1021,0±0,9476,1±2,2976,0±0,4567,9±2,280,25,6±1,3321,3±1,2122,8±3,0128,1±1,8040,5±1,40113,7±1,28111,9±1,38105,5±2,050,314,7±1,6026,8±1,5228,4±1,4843,9±1,5855,7±0,97134,9±1,25139,8±2,04124,3±3,020,418,3±2,0933,8±1,8842,8±2,4454,0±2,2773,8±2,16147,0±1,94153,2±4,69138,4±3,030,518,2±2,3236,9±2,1245,0±2,5465,6±2,2179,4±1,74167,6±2,81168,1±3,80145,9±2,860,619,1±3,1642,2±2,4654,2±2,5779,6±2,7988,4±1,94169,8±2,65176,2±4,25158,0±3,290,724,0±2,4848,9±2,5655,5±2,7082,7±2,8891,6±2,83183,7±2,67181,8±3,82166,4±3,990,826,3±3,3453,1±2,9965,1±3,1390,1±3,1199,1±4,38204,8±3,57195,8±5,06180,4±5,450,927,6±3,7357,9±3,2272,2±3,2495,8±3,14112,0±4,04224,7±5,10213,1±5,97193,4±6,45131,0±4,0270,3±4,4893,5±5,62117,7±5,12139,0±6,09272,5±12,73286,3±19,88251,1±21,30- 46 -Относительная интенсивностьДлительность (мс)40501002003004005000,159,5±0,7562,0±0,6151,3±0,6049,1±1,4840,8±1,22n/а31,8±1,590,287,0±0,8985,8±1,2371,5±0,5468,3±2,4858,6±2,07n/а51,1±3,240,3108,2±1,77101,1±2,0389,3±2,4382,1±3,6070,7±2,29n/а62,9±4,300,4127,1±3,47116,4±2,97102,1±3,2193,1±5,5079,4±1,60n/а71,8±4,410,5134,1±3,45125,2±2,80116,7±6,4799,3±4,0191,2±4,1076,3±2,5579,9±5,040,6140,7±3,37133,9±3,89129,8±10,43110,8±6,2195,9±3,4182,6±2,7487,3±6,870,7151,2±4,22144,6±4,67123,0±4,58111,6±4,71105,1±5,9194,5±2,4293,1±5,370,8169,2±8,11147,3±3,78131,2±6,50116,4±5,50106,9±3,6097,4±3,9099,4±6,410,9178,1±11,71151,0±4,36136,9±7,01121,8±4,61113,7±4,18105,1±4,84105,5±7,531222,2±21,15200,2±21,52172,8±23,67149,0±22,20140,3±22,09132,1±22,25129,2±24,22Рис.
9. Зависимость значения амплитуды мембранного тока нейронов гиппокампа отдлительности светового стимула (1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500 мс) приразных интенсивностях света (ось абсцисс указана в логарифмическом масштабе, максимальноезначение Imax=35 мВ·мм-2 принималось за 1).Для обобщения полученных результатов и их дальнейшего использования напрактике была построена диаграмма, в которой по оси абсцисс отмечалидлительность светового стимула, по оси ординат отмечали разницу междуамплитудами мембранных токов первого и второго ответов на световой стимул(Рис. 10).
Динамика амплитуды мембранных токов при разных интенсивностях идлительностях светового импульса для одного нейрона приведена в приложении 3.- 48 -Рис. 10. Диаграмма, отображающая зависимость между разницей амплитуд мембранноготока первого и второго стимулов (∆) и длительностью светового стимула (1 мс, 10 мс, 300 мс)при разных интенсивностях светового потока. Маркерами обозначены относительныеинтенсивности, максимальная интенсивность была принята за единицу.Наименьший разброс между значениями амплитуд мембранных токов первогои второго ответов на световой стимул приходится на промежуток длительностейсветового стимула 10-30 мс. При увеличении длительности светового стимуларазница между значениями амплитуд мембранных токов увеличивается, т.е. чемдольше происходит световая многократная стимуляция, тем меньше становитсязначение амплитуды фототоков.
Объяснением такой корреляции может бытьинактивация части каналородопсинов-2 при длительной световой стимуляции [31].- 49 -Впервые объяснение этого факта для одного канала было предложено вработе [7], где рассматривалась модель фотоцикла ChR2, состоящая из трехсостояний: открытого (O), десенсибилизированного (D) и закрытого (C). Однакопосле спектрального исследования каналородопсина-2 [36], результаты которогоуказали на существование четырех кинетических состояний P1, P2, P3 и P4 (рис.
11),были предложены другие модели, описывающие кинетику ChR2: модель четырех[54,55] и шести [60] состояний. В качестве основной модели для объясненияполученных в диссертационной работе результатов была использована модельчетырех состояний.Рис. 11. Схема фотоцикла на основе спектрального анализа [54].В этой модели выделялись два открытых состояния (O1 → O2) и два закрытых(C1 → C2), при этом состояние O2 обладало меньшей проводимостью, а состояниеC2 длилось порядка секунд, что может объяснить потерю чувствительности частиканалородопсинов-2 при длительных световых стимуляциях (Рис.
9). Состояния,- 50 -определенныев спектральноманализеканала, можно интерпретироватьследующим образом O1 → O2 соответствуют состояниям P2 и P3 (открытыесостояния с постоянной времени 1 мс и 10 мс соответственно), состояние C2(постоянная времени 5 с) соответствует состоянию P4 (десенсибилизированное).Состояние C1 является основным состоянием канала и соответствует P0 [54].Вероятно, при больших длительностях светового стимула начинает преобладатьсостояние P4, которое переводит канал в десенсибилизированное состояние, чтообъясняет полученные результаты (Рис.
9, 10).3.3Зависимость амплитуды мембранного тока от интенсивностисветового стимулаДалеебылаопределеназависимостьмеждузначениямиамплитудымембранного тока пирамидного нейрона гиппокампа, экспрессирующего ChR2, отинтенсивности светового стимула (рис. 12).В качестве длительности светового импульса выбрано значение, при которомамплитуда тока была максимальной – 20 мс. Полученные результатыдемонстрировалиинтенсивностиблизкуюсветовогоклинейнойвоздействияизависимостьамплитудоймеждуизменениеммембранноготока,аналогичные результаты были получены для других значений длительностистимула (рис. 12).- 51 -Рис. 12.
Зависимость амплитуды мембранного тока от интенсивности светового стимулапри разных длительностях светового импульса 1-5 мс (сверху), 10-50 мс (в центре), 100-500 мс(снизу).- 52 -Во всем диапазоне длительностей светового стимула при увеличенииинтенсивности светового потока происходит увеличение значения амплитудымембранного тока пирамидного нейрона, экспрессирующего ChR2.Таким образом, можно сделать вывод о том, что максимальное значениеамплитуды мембранного тока, вызванного световым воздействием, достигаетсяпри максимальной интенсивности в диапазоне длительностей светового стимула10-30 мс. Все выявленные зависимости согласуется с опубликованными ранее дляChR2 [7,54].3.4.Время достижения максимума амплитуды (τ)Представленные ранее зависимости характеризуют изменение амплитудысветоиндуцированных токов в зависимости от выбранных параметров световогостимула. Одним из важных параметров наравне, с амплитудой фототоков, которыйнеобходимо учитывать при выборе параметров световой стимуляции, являетсявремя (τ).
Под τ понимается временной интервал между началом световойстимуляции и моментом достижения максимального значения амплитудымембранноготока.Нарисунке13изображеныфоторецепторныетоки,зарегистрированные при разных длительностях светового стимула (1-5 мс, 10-50мс, 100-500 мс) на которых отчетливо прослеживается изменение параметра τ взависимости от длительности светового стимула.- 53 -Рис.
13. Светоиндуцированные мембранные токи, зарегистрированные при (F = 1 Гц, I = Imax)разных длительностях светового импульса 1-5 мс (слева), 10-50 мс (по центру), 100-500 мс(справа), полученные в режиме фиксации потенциала конфигурации «целая-клетка».- 54 -Полученные результаты показали, что при увеличении длительностисветового стимула увеличивается τ, однако это происходит до длительностисветового стимула (t) равного 50 мс включительно, после чего кривая зависимостиτ(t) выходит на плато (Рис. 14).Рис.
14. Фототоки зарегистрированные в режиме фиксации потенциала конфигурации целаяклетка при длительности светового стимула t = 100мс, T = 1Гц, I = Imax (слева), зависимостьвремени τ от длительности светового стимула (справа).Вид зависимости τ(t), вероятно, можно объяснить тем, что множество ChR2каналов синхронизуются между собой, и время этой синхронизации в среднемзанимает 50 мс. Подтверждением этого факта может служить значение амплитудыпервого ответа нейрона при световом возбуждении, который всегда имеет самоебольшое значение, по сравнению с остальными значениями амплитуд. Т.е. сначаласистема ChR2 каналов открывается одномоментно, что дает максимальный потокионовчерезмембрану,послечегочастьканаловнаходитсявдесенсибилизированном состоянии (см. фотоцикл ChR2 рис.
11), а часть каналов вактивном. После чего чередование этих состояний входит в некотороесинхронизованное состояние, что объясняется выходом зависимости τ(t) на плато.- 55 -Чтобы удостовериться, что полученные результаты являются достоверными,т.е. кинетические свойства фототоков ChR2 являются собственными поотношению к системе каналов и не специфичны для конкретного типа нейронов, вкоторомэтиканалыэкспрессировались,былипроведеныаналогичныеэксперименты на клетках HEK -293T (данные не приводятся), трансфецированныхChR2. Электрофизиологические записи, полученные в ответ на световые стимулысиним светом с максимумом возбуждения 470 нм, были схожими в клетках HEK 293T и нейронах гиппокампа (данные не приведены).Помимо типа клеток, в которых экспрессируется ChR2, на кинетику каналаможет влиять внутриклеточная среда, в частности, изменение уровня свободноговнутриклеточного кальция, который может приводить к изменению свойствразличных ионных каналов [61,62].
В работе [54] опубликованы данные о том, чтопри измерении фототоков у нейронов гиппокампа в присутствии кальцийспецифическойаминополикарбоновойкислоты(BAPTA)кинетикаChR2оставалась неизменной. Наконец, остается вероятность того, что на кинетикуканала может влиять флуоресцентная метка. Однако в статье [54] заменафлуоресцентной метки на короткую не флуоресцирующую часть не оказалавлияния на кинетику каналородопсинов-2. Таким образом, можно сделать вывод отом, что полученные результаты являются достоверными в отношении кинетикиChR2.- 56 -3.5.Сравнение активности пирамидных нейронов гиппокампа мышей,экспрессирующих каналородопсин-2, дикого типа и мышей-модели БолезниАльцгеймераНа основе полученных зависимостей (рис. 9, 12, 14) выбраны параметрысветового стимула, необходимые для сравнения активности нейронов гиппокампамышей дикого типа и мышей-модели Болезни Альцгеймера (БА).Выбор трансгенной линии был обусловлен тем, что у мышей-модели БА(экспрессирующих мутантный белок пресенелин-1), несмотря на отсутствиеамилоидных отложений в мозгу, ученые обнаружили возникновение дефектовпамяти, начиная с 3–4 месячного возраста [63,64], а также аномалии в активностинейронов,обусловленныесигнализации.«Кальциевая»концентрацииионовCa2+нарушениемгипотезаввнутриклеточнойсвязанаснарушениемэндоплазматическомкальциевойрегуляцииретикулуме(ЭР),преимущественно в случае, когда в этот процесс вовлечены мутантные вариантыбелков пресенилинов [65,66].Известно, что стабилизация процесса поддержания внутриклеточнойконцентрацииионовCa2+имеетважноезначениедлясохраненияжизнеспособности нейронов и является основным компонентом синаптическойпередачи [67].Использование светочувствительных ионных каналов (опсинов) можетоткрыть путь к пониманию механизмов, вызывающих различные патологии инарушения, например, при БА.Для сравнения активности нейронов контрольной и мутантной группыоптогенетическим методом были выбраны следующие параметры световойстимуляции: длительность светового стимула – 10 мс, частота – 1 Гц,- 57 -интенсивность – Imax.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
