Диссертация (1144318), страница 7
Текст из файла (страница 7)
В режиме фиксации тока в конфигурации «целая клетка»осуществлялось измерение потенциалов на мембране пирамидных нейроновгиппокампа мышей дикого типа и мышей-модели БА в ответ на световой стимул сзаданными параметрами (Рис. 15).Рис. 15. Активность нейронов гиппокампа мышей, экспрессирующих ChR2, дикого типа имышей-модели БА при возбуждении синим светом (470 нм, t = 10 мс, T = 1 Гц, I = Imax),зарегистрированная в режиме фиксации тока, конфигурация «целая-клетка».Рис. 16.
Активность нейронов гиппокампа мышей, экспрессирующих ChR2, дикого типа имышей-модели БА, A – в ответ на инъекцию током (50 пА, t = 1 с) [68], Б – при возбуждениисиним светом (470 нм, t = 500 мс, T = 1 Гц, I = Imax).- 59 -При сравнение светоиндуцированных ПД у здоровых клеток и клеток спатологией БА не было обнаружено достоверных отличий при многократнойсветовой стимуляции в подобранных условиях.
По этой причине длительностьсветового стимула была увеличена и выбрана по аналогии с электростимуляцией(Рис. 16) [68]. Далее были проведены аналогичные измерения со следующимипараметрами светового стимула: t = 500 мс, T = 1 Гц, I = Imax. Результатыпредставлены на рисунке 17.Рис. 17.
(А) Активность нейронов гиппокампа мышей дикого типа и мышей-модели БА при возбуждении синим светом (470 нм,t = 500 мс, T = 1 Гц, I = Imax), зарегистрированная в режиме фиксации тока, конфигурация «целая-клетка». (Б) – Активность нейроновгиппокампа мышей дикого типа и мышей-модели БА в ответ на первый световой стимул.Рис 18. Динамика изменения амплитуды ПД у нейронов гиппокампа, экспрессирующих ChR2,мышей дикого типа (A) и мышей-модели БА (Б) при световой стимуляции(t = 500 мс, F = 1 Гц, I = Imax).Полученные результаты показали (Рис. 18, 19) изменение амплитуды иколичества ПД у нейронов гиппокампа мышей дикого типа и мышей-модели БА.Количество светоиндуцированных ПД у клеток с патологией на протяжении всего- 62 -периода световой стимуляции было достоверно больше, чем у контрольной группыклеток. При этом значение амплитуды ПД у патологических клеток былодостоверно меньше, чем у нейронов контрольной группы.Рис.19.
Динамика изменения количества ПД у нейронов гиппокампа, экспрессирующих ChR2,мышей дикого типа (A) и мышей-модели БА (Б) при световой стимуляции(t = 500 мс, F = 1 Гц, I = Imax).- 63 -Результаты проведенных в работе исследований показали, что приоптогенетической стимуляции нейронов гиппокампа мышей-моделей БА сповышенной концентрацией ионов кальция в эндоплазматическом ретикулуме,связанной с мутациями в генах пресенелина-1, наблюдается увеличение количестваПД и уменьшение их амплитуды во время светового воздействия по отношению кконтрольным нейронам.
Разницу в активности нейронов гиппокампа при световойстимуляции между нейронами контрольной группы и нейронами с патологией БАможно объяснить разным начальным потенциалом на мембране, который можетбыть связан с нарушением кальциевого обмена у мышей-моделей БА. У нейроновс патологией БА мембранный потенциал всегда был смещен в положительнуюобласть, а значит, нейроны были более возбудимы.
На рис. 20 нагляднопродемонстрирована разница в генерации потенциалов действия у здоровыхнейронов и нейронов с патологией БА, экспрессирующих каналородопсин-2.- 64 -Рис. 20. Генерация потенциалов действия, индуцированная синим светом (470нм, t =500мс, F = 1Гц, I = Imax), записанная в режиме фиксации тока, конфигурация «целая клетка» длянейронов дикого типа (сверху) и нейронов мышей-моделей БА (снизу). Значения мембранныхпотенциалов указаны без учета погрешности liquid junction potential 2 .Таким образом, следует отметить, что наряду с выявленными ранее отличиямив активности нейронов дикого типа и БА, с помощью химической активации путемингибирования ГАМК-рецепторов, электрической стимуляции [68], оптическаястимуляция и оптогенетические инструменты позволили выявить новые отличия.2Потенциал жидкого перехода, возникает, когда два раствора электролитов разной концентрацииконтактируют друг с другом.- 65 -Молекулярно-клеточные механизмы этого явления могут служить предметом длядальнейших исследований как фундаментального, так и прикладного характера.3.6.Генерация светоиндуцированных потенциалов действия вэкспериментах с биологической обратной связьюБиологическаяобратнаясвязьпредставляеткомплексизэлектрофизиологического оборудования и специализированного компьютерногопрограммного обеспечения.
Цель этой системы – отслеживать активностьнейрона(ов), в момент обнаружения заданной в программе активности, например,определенной формы ПД в виде иктального разряда (характерной нейроннойактивности, предшествующей эпилептическим разрядам в головном мозге),подавать световой стимул на целевую группу нейронов, экспрессирующихопсин(ы), например, каналородопсины-2.В данном исследовании на основе определенных ранее зависимостей былиопределены параметры светового стимула, при которых система отслеживаласпонтанно генерируемый потенциал действия, после чего осуществляла световуюстимуляцию (t = 20 мс, F = 1 Гц, I = Imax), вызывающую генерация следующего ПД(рис.
21). Полученные результаты позволят в дальнейшем использоватьподобранные и апробированные параметры световой стимуляции в экспериментахна животных эпилептической модели для подавления интериктальных разрядов(подобных эпилептическим разрядам в головном мозге).- 66 -Рис. 21. Биологическая обратная связь с нейроном в первичной культуре гиппокампа(инициация второго ПД после световой стимуляции t = 20 мс, F = 1 Гц, I = Imax), а – спонтанновозникший потенциал действия нейрона в отсутствие световой стимуляции; б – дублет,имитированный системой обратной связи, он же в увеличенном масштабе приведен на графике(г). На графиках а, б и г сверху приведена динамика мембранного потенциала во времени, а снизу– динамика света длиной волны 470 нм, включаемого в режиме обратной связи; в – фотографияфлуоресцирующего нейрона.- 67 -ЗАКЛЮЧЕНИЕВ настоящем исследовании оценено влияние длительности, частоты иинтенсивности светового воздействия на активность нейронов гиппокампа in vitroс экзогенной экспрессией светочувствительных каналов Chlamydomonas ChR2.
Наоснове полученных данных проведено также оптогенетическое сравнениеэлектрофизиологической активности нейронов гиппокампа в норме и припатологии. Подобраны необходимые и достаточные параметры световойстимуляции в экспериментах с биологической обратной связью.Определен интервал длительностей светового импульса – 10-30 мс, прикотором значение амплитуды мембранного тока достигает максимума. Показано,что при увеличении интенсивности светового стимула увеличивается значениеамплитуды мембранного тока.В результате оптогенетического сравнения активности нейронов гиппокампалинии дикого типа и трансгенной линии PS1-M146V knock-in (KI) модели БАвыявлены различия в количестве светоиндуцированных потенциалов действия вначальный момент и с течением времени.
При световой стимуляции нейроновмышей-моделей БА с нарушением внутриклеточной кальциевой сигнализациинаблюдается увеличение числа ПД и уменьшение их амплитуды во время световоговоздействия по отношению к контрольным нейронам мышей дикого типа.В экспериментах с биологической обратной связью путем подборанеобходимых параметров (t = 20 мс, F = 1 Гц, I = Imax) светового стимула удалосьдобиться стабильной светоиндуцированной генерации ПД.- 68 -РЕЗУЛЬТАТЫ ДИСЕРТАЦИОННОГО ИССЛЕДОВАНИЯ1.Настроеноэкспериментальноесоответствующиепротоколыоборудованиедляипроведенияразработаныоптогенетическихэкспериментов.2.Освоеноптогенетическийметоднапервичнойкультуренейроновгиппокампа мышей.3.Определена частота светового стимула, при которой будут генерироватьсяпотенциалы действия на протяжении всего периода стимуляции.4.Определена зависимость амплитуды мембранного тока от длительности иинтенсивности светового стимула.5.Определена зависимость времени достижения максимума амплитудымембранного тока (τ) от длительности светового стимула.6.Определены рабочие параметры светового стимула на основе полученныхранее зависимостей и применены в эксперименте.- 69 -ВЫВОДЫ1.Частота следования светового импульса 1 Гц вызывает стабильнуюгенерацию потенциалов действия у нейронов гиппокампа в культуре.2.Зависимость величины амплитуды мембранного тока нейронов гиппокампа,экспрессирующих каналородопсин-2, от длительности светового стимула (t)при многократно повторяющихся воздействиях имеет нелинейный характерс максимумом в диапазоне длительностей 10-30мс.3.Величинаамплитудыэкспрессирующихмембранногоканалородопсин-2,токанейроноввозрастаетпригиппокампа,увеличенииинтенсивности светового стимула в ходе многократно повторяющегосявоздействия.4.Значение времени достижения максимума амплитуды (τ) возрастает приувеличении длительности светового стимула (t) до t = 50 мс, после чегозависимость τ(t) выходит на плато.5.Нейроны гиппокампа трансгенной линии PS1-M146V knock-in (KI) моделиБА, экспрессирующие каналородопсин-2, генерирует достоверно большееколичество ПД с меньшей амплитудой по сравнению с контрольной группойнейронов гиппокампа мышей дикого типа.6.При длительности светового стимула 20 мс, частоте 1 Гц и максимальнойинтенсивности генерируется потенциал действия в эксперименте сбиологической обратной связью.- 70 -СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ1.Hutcheon B., Yarom Y.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
