Диссертация (1144318), страница 5
Текст из файла (страница 5)
При постановкеэкспериментов необходимо также учитывать, что ткани мозга млекопитающихсильно поглощают свет – на расстоянии 500 мкм от края волокна интенсивностьсветового пучка составляет примерно 10% от исходной интенсивности.Несмотря на то, что оптогенетика является одной из самых развивающихсяобластей в нейробиологии, есть некоторые открытые вопросы, связанные сдинамикой токов через опсины, в частности каналородпсин-2.Для каналородопсина-2 была описана кинетика токов и возможные вариантыфотоциклов [7,54,55], также определена его структура [56].
Тем не менее в этихработах не было данных о том, как изменяется кинетика канала при длительноммногократном световом воздействии. Поэтому возникла необходимость изучитьдетали динамики ChR2 при длительном импульсном воздействии, такие какзависимость амплитуды мембранных фототоков от длительности, интенсивности ичастоты светового стимула, а также определить время достижения максимумафототоков. Анализ динамики мембранных токов и потенциалов, индуцированныхсветом, важен для эффективности применения оптогенетики и правильнойинтерпретации полученных результатов.- 35 -Глава 2.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯОбъектомисследованиядиссертационногоисследованияявляютсяпирамидные нейроны гиппокампа в первичной культуре, экспрессирующие ChR2.Предметом исследования диссертационной работы является системаканалородопсинов-2, в частности режимы стабильной работы системы каналов примногократной световой стимуляции.В ходе работы применялись следующие методы: культивированиедиссоциированных нейронов гиппокампа мышей, выделение плазмидной ДНК,кальций-фосфатная ко-трансфекция, метод локальной фиксации потенциала(«patch-clamp»), методы статистической обработки. Основные этапы выполненияработы представлены на рисунке 5.2.1Линии мышейВсе эксперименты, использованные в этом диссертационном исследовании,были одобрены комиссией по уходу и использованию лабораторных животныхФГБУ НИИ гриппа имени А.А.
Смородинцева Министерства ЗдравоохраненияРоссийской Федерации. В работе использовались следующие линии мышей:Рапполово (Россия), PS1-M146V knock-in и дикий тип мышей B6 (C57BL / 6 J, №000664), полученные из «The Jackson Laboratory» (США). Уход и содержаниеэкспериментальных животных были стандартными и соответствовали всемнеобходимым требованиям. Животных содержали в виварии, расположенном вЛабораториимолекулярнойнейродегенерациивСанкт-Петербургскомполитехническом университете Петра Великого. Уход и содержание животныхосуществляли в контролируемых условиях: 4-5 особей в клетке, 12-часовой периодосвещения, комнатная температура 20±2°С, влажность 50-70%.- 36 -2.2ДлявыделенияПервичная культура гиппокампапервичнойдиссоциированнойкультурынейроновгиппокампа мышей использовались новорожденные мышата в возрасте до двухдней.
Получение первичной культуры осуществляли по протоколу, описанному встатье [57]. Рост культуры осуществляли в инкубаторе с 5% содержанием СО2 притемпературе +37оС в 24-луночном планшете на стеклах диаметром 12 мм. Стеклапредварительно отмывали по 30 минут в ацетоне, в 100% и 70% этаноле, затемвысушивали и покрывали поли-D-лизином (Sigma, #27964) в концентрации 0,1мг/мл и инкубировали в течение 3 часов при температуре +37оС или при +4оС втечение 16 часов. При избыточном росте глиальных клеток культуру обрабатывалиингибитором пролиферации Ara-C (цитозин β-D- арабинофуранозид) (Sigma,#C1768) в конечной концентрации 40 мкМ на 3-й день культивирования (DIV). На7-й DIV проводили кальций-фосфатную трансфекцию. На 14-й DIV в каждуюлунку добавлялось по 0,5 мл свежей среды (Neurobasal А, 0,5 мМ L-глутамин, 2%B27).Рис.
5. Основные методики и этапы выполнения работы2.3Кальций-фосфатная трансфекцияВведение плазмиды FCK-ChR2-GFP (Addgene, #15814) в нейроныгиппокампа in vitro осуществляли методом кальций-фосфатной трансфекции.Данную процедура проводили на 7-й день после получения первичной культурыпри помощи набора (Clontech Laboratories Inc., #631312,) по протоколупроизводителя с рекомендациями, согласно статье [58].
По причине того, что длинавозбуждения (470нм) флуоресцентной метки (GFP) совпадает с длинойвозбуждения каналородопсина-2, использовали вторую маркерную плазмидаpCSCMV:tdTomato (Addgene, #30530), кодирующая красный флуоресцентныйбелок с длиной волны возбуждения 530 нм. Для введения двух плазмидиспользовали метод кальций-фосфатной ко-трансфекции. Для этого плазмидысмешивались в соотношении 3:1, где 3 части составляла плазмида интереса, т.е.FCK-ChR2-GFP (см.
приложение 1).2.4Метод локальной фиксации потенциалаРегистрацию активности нейронов в первичной культуре гиппокампа мышейпроводили в режиме фиксации потенциала и тока в конфигурации «целая-клетка»на 14-16 день после выделения первичной культуры гиппокампа.Дляпроведенияэкспериментовиспользовалиомывающийрастворискусственной спинномозговой жидкости (ACSF) следующего состава: NaCl (124мM), KCl (5 мM), NaHCO3 (26 мM), NaH2PO4 (1 мM), CaCl2 (2,5 мM), MgCl2 (1,3мM), glucose (10 мM), pH 7,4; 290-310 мОсм. Подробный расчет солей указан вприложении 1.Поиск нейронов осуществляли на микроскопе Olympus IX73 в связке с 4диодным источником света и управляющим устройством Thorlabs DC4104. Длязаписи активности нейронов, экспрессирующих каналородопсины-2 отбирали- 39 -пирамидные нейроны гиппокампа, флуоресцирующие при возбуждении зеленым(530 нм) и синим светом (470 нм).
После выбора клетки с помощьюмикроманипулятораSiskiyouMX7600Lкнейподводилистеклянныймикроэлектрод, заполненный следующим раствором: K-глюканат (140 мM), MgCl2(2 мM), NaCl (2 мM), ATP-Na (2 мM), GTP-Mg (0.3 мM), HEPES (10 мM), pH 7,35;290-310 мОсм. Подробный расчет солей указан в приложении 1.В момент начала образования плотного контакта клетку фиксировали спотенциалом -70 мВ.
Микроэлектрод изготавливали на пуллере Sutter InstrumentP-1000 из боросиликатного стекла с наружным диаметром 1,5 мм и внутреннимдиаметром 0,86 мм (Sutter Instrument) с сопротивлением 3-5 МОм. Записьактивности пирамидных нейронов осуществлялась в режиме фиксации тока ипотенциала в конфигурации «целая-клетка».Активность нейрона регистрировали в программе pCLAMP 10.7 (MolecularDevices) с помощью усилителя MultiClamp 700B (Molecular Devices) и цифровогопреобразователя Digidata 1440A (Molecular Devices).2.5Оптогенетический методНа 14 день после получения первичной культуры гиппокампа, т.е. через 7дней после кальций-фосфатной ко-трансфекции осуществляли запись активностинейронов.Во время измерения активности нейронов гиппокампа, экспрессирующихChR2 (рис.
6), осуществляли световую стимуляцию синим светодиодом (λ = 470нм, Imax = 35 мВ·мм-2, φmax = 250 мВ). Максимальное значение интенсивности былопринято за единицу, все последующие значения интенсивностей рассчитывали, какпроцентотмаксимальногоинтенсивность».значенияиобозначаликак«относительная- 40 -Рис.6.Пирамидальныйнейрон,экспрессирующийChR2,вовремязаписифоторецепторных токов методом локальной фиксации потенциала. А – изображение, полученноечерно-белой камерой при обычном освещении; Б – изображение, полученное черно-белойкамерой при возбуждении зеленым светом с максимумом возбуждения 530 нм.Для описания динамики мембранных фототоков и потенциалов былопроведено 10 измерений для каждой длительности светового импульса 1-5 мс, 1050 мс и 100-500 мс при разных интенсивностях (рис. 7).Рис.7.Фототокипирамидальногонейрона,экспрессирующегоChR2,зарегистрированные в режиме фиксации потенциала в конфигурации «целая-клетка» во времясветовой стимуляции (t = 100 мс, I = Imax, F = 1 Гц)- 41 -2.6ЗаписьМетоды статистической обработкиактивностинейронов,экспрессирующихканалородопсин-2,осуществляли в программном пакете pClamp 10.7 (Molecular Devices).
Длястатистической обработки данных полученные записи экспортировались изClampfit 10.7, входящим в состав pClamp 10.7, в программный пакет для анализачисловыхданныхипостроенияграфиковOriginPro9.0.Построениерепрезентативных данных (рис. 7-8) осуществляли программном пакете Clampfit10.7. Построение графиков осуществляли в программном пакете для анализа ипредставления научных данных GraphPad Prism 7. Результаты представляли каксреднее ± стандартная ошибка среднего (SE).Среднее арифметическое считали по следующей формуле:##$*!̅ = ∑$&'# !& = (!# +. .
. +!$ )Стандартную ошибку считали следующим образом:2/0*̅ = 1 ∑3(* 5*̅ )63 472 4√$, где/0*̅ – стандартная ошибка среднего, !& - i-й элемент выборки, 9 - объём выборки,!̅ - среднее арифметическое выборки.Для рисунков 9 и 12 применялось полиномиальное сглаживание в программеGraphPad Prism 7 методом Савицкого-Голея, в котором количество соседних точекдля усреднения равнялось 2, а порядок сглаживающего полинома был равен 4. Длясглаживания использовалась следующая формула::; = ∑?@26?@2&' 6<& =;># ,A5#B≤ D ≤ 9 −A5#Bданные состоят из набора 9{!; , =; } точек (от j = 1, …, n), где x – независимаяпеременная, а =; – наблюдаемая величина, m – коэффициент свертки.- 42 -Статистическое сравнение результатов, полученных в экспериментах, гдесравниваласьактивностьпирамидныхнейроновгиппокампамышей,экспрессирующих каналородопсин-2, дикого типа и мышей-модели БолезниАльцгеймера, проводили с помощью t-критерия Стьюдента или однофакторногодисперсионного анализа ANOVA с последующим многократным сопоставлениемпо Бонферрони * p <0,05.Результаты, приведенные в данном исследовании, получены на основе данныхмембранных токов и потенциалов первичных нейронов гиппокампа 10 культур.- 43 -Глава 3.
ПАРАМЕТРЫ СВЕТОВОЙ СТИМУЛЯЦИИДля выявления зависимостей между световым стимулом и активностьюпирамидного нейрона, экспрессирующего каналородопсин-2, от параметровсветовой стимуляции (интенсивности воздействующегосвета, частотыследования и длительности импульсов) были проведены серии экспериментов.3.1Зависимость между частотой светового стимула и генерациейпотенциалов действияДля определения корреляции между активностью пирамидного нейронагиппокампа, экспрессирующего ChR2 и параметрами светового стимула былипроведены эксперименты, в которых при многократной световой стимуляции – 10стимулов, подбиралась частота, при которой на каждый световой стимулгенерировался ответный потенциал действия (ПД) (рис. 8).
Рассматриваласьименно генерация ПД, т.к. при любой заданной частоте происходило изменениемембранных токов в ответ на световые стимулы.Рис. 8. Генерация потенциалов действия у пирамидного нейрона гиппокампа,экспрессирующего каналородопсин-2, при разных значениях частоты светового стимула (t = 20мс, Imax)- 44 -Согласно полученным результатам было выбрано значение частоты, равное 1Гц. Все дальнейшие измерения проводили с этой частотой. Результаты схожи сданными, опубликованными в статье [59], однако, начиная со значения 5 Гц ивыше, наблюдаются расхождения в количестве генерируемых светозависимыхпотенциалов действия. Данный факт можно объяснить разным уровнем экспрессииChR2, о чем также говорят авторы статьи [59].3.2Зависимость амплитуды мембранного тока от длительностисветового стимулаНа следующем этапе работы оценивали влияние длительности световогостимула (1-5 мс, 10-50 мс, 100-500 мс) на амплитуду мембранного тока при разныхинтенсивностях светодиода (Рис.
9). Кривая зависимости значения амплитудымембранного тока от длительности светового стимула имеет максимум в диапазонедлительностей от 10 до 30 мс с последующим спадом на длительностях 100-500 мс.Падение значения амплитуды мембранного тока при больших длительностяхсветового стимула (100-500 мс) в случае многократного воздействия может бытьобусловлено десенсибилизацией части каналородопсинов-2 [31]. Максимальноезначение амплитуды мембранных фототоков составило – 418 пА при длительностисветового стимула 20 мс, среднее значение амплитуды 286,3 ± 19,88 пА (табл.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
