Диссертация (1144318), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Это необходимо для правильнойинтерпретации полученных данных.- 26 -Несмотря на множество полезных свойств, ни один из перечисленных вышеChR не способен изменять мембранные токи и потенциалы при частоте выше 40Гц, в то время как многие типы нейронов и их физиологические процессы требуютвысокочастотных изменений токов и потенциалов клеточной мембранны (>40 Гц).Даже дикий тип ChR2 (10 мс), а также и H134R (20 мс), неспособны к точномууправлению на высоких частотах. Замена в ChR2 остатков глутамата-123 натреонин или аланин привело к ускорению времени закрытия канала от 10 мс до 4мс, за счет умеренного снижения величины фототока, что значительно повысилоточность оптогенетического контроля [24].
Замены в положении E123 являютсяуникальными среди ChR, так как устраняют чувствительность кинетики канала кмембранным потенциалам, будь то отдельно или в комбинации с другимизаменами H134R и T159C [24,39]. После устранения этих нелинейных инестационарных эффектов ответ каналов становится более предсказуемым и легкомоделируемым. Опсины этого класса (замены E123 отдельно или в комбинации сдругими заменами [24]), называются ChETAs (ChRE123T/A). ChETA могут бытьиспользованы не только для нейронов, требующих высокочастотных измененийтоков и потенциалов клеточной мембранны, так как их использование приводит кснижению появления дополнительных пиков (наряду со снижением ложнопролонгированной деполяризации).
Было показано, что ChETA обеспечиваютповышеннуюпроизводительностьвпределахинтактныхтканеймозгамлекопитающих [24], в то же время быстрая деактивация, как правило, приводит кснижению эффективной клеточной чувствительности к длительным импульсамсвета, так как меньше каналов остаются открытыми.Фармакологическая,оптогентическаяиэлектро-стимуляциибудутотличаться по сравнению с естественной синаптической передачей из-за изменения- 27 -проводимости, потоков ионов и мембранного потенциала.
Любой из этих методовможет повлиять на внутриклеточные мембраны, эндоплазматический ретикулум,ядерный аппарат, синаптические везикулы и митохондрии. Эти факторынеобходимо учитывать, особенно при изучении одиночных нейронов. И несмотряна то, что оптогенетические методы являются более новыми, точными испецифичными, стоит сопоставлять их с результатами электростимуляции вподобных условиях. Хотя оптогенетика дает возможность понять, как именнофункционируют нейроны и нейронные ансамбли, экспериментальные результатыбудут сильнейшим образом зависеть от типа нейронов, от параметров стимуляции(частота, длительность, амплитуда и тд).
Огромное влияние оказывает также выборопсина (например, H134R или L132C).1.6Быстрое ингибирование– галородопсины (NpHR)Для изучения активности нейронов и нейронных ансамблей ингибированиетакже играет огромную роль в оптогенетических исследованиях. Для достиженияэтихцелей используетсягалородопсин –halobacterial HR(индуцируетэлектрогенный ток ионов хлора), однако он проявляет десенсибилизацию. Тем неменее, гомологичный ген от Natronomonas pharaonis [40–42] способен вызватьстабильный фототок [43] с пиком при 590 нм (длина волны, которая не вызываетникакого ответа от ChR2, что позволяет осуществить независимую активацииChR2 и NpHR для двунаправленной модуляции активности). В отличие отвозбуждающих ChR, NpHR требует постоянного воздействия светом.
Хотяторможение с использованием NpHR было успешно показано в модели свободнодвижущихся червей и тонких срезов мозга млекопитающих [43], а также в культуренейронов [44], потребовалось несколько лет, прежде чем удалось достигнуть- 28 -подобных результатов у интактных млекопитающих из-за проблем мембранноготранспорта, которые требуют использования дополнительных методик.Различными генно-инженерными методами был создан опсин eNpHR2.0,характеризуемый более высокими значениями токов [22,45], что позволяетиспользовать его для интактной ткани грызунов [46], а также тканей приматов ичеловека [47].
В конечном итоге был получен eNpHR3.0, характеризующийся ещебольшими значениями фототоков при умеренной интенсивности света в желтомдиапазоне или смещеннием в красную зону (до 680 нм) [34].Следует отметить, что для опытов по ингибированию функции нейроновцелесообразно использовать двунаправленный контроль, а также учитыватьвлияние стабильности фототоков.
Наконец, необходимо проявлять осторожность,в частности, чтобы избежать нагрева тканей при непрерывном воздействии.Поэтомуважноконтролироватьинтенсивностьсвета,необходимуюдляторможения [48].1.7Инструменты для модуляции биохимического сигналингаМикробные гены опсинов (тип I), описанные выше, кодируют ионныеканалы, которые контролируют возбудимость нейронов, изменяя их мембранныйпотенциал выше или ниже порога генерации потенциала действия. Такой подходимеет преимущества в виде скорости и точности воздействия, однако в некоторыхэкспериментах необходима временная и точная модуляция внутриклеточныхпроцессов.Существует еще один тип опсинов (тип II) – например, светочувствительныебелки глаза млекопитающих, которые способны не только индуцировать фототокпод действием света, но и выступать в качестве GPCR, а значит участвовать вовнутриклеточной сигнализации.
Таким образом, можно осуществить медленный- 29 -тормозящий [49] или возбуждающий [50] контроль. В настоящее времяразрабатывается большое количество химер [51] между родопсинами позвоночныхи GPCRs, которые могут служить как однокомпонентные инструменты контроля(такиекакдофаминергический,серотонинергическийиадренергическийрецепторы, которые играют важную роль в нейротрансмиссии и нейромодуляции).Такие оптогенетические инструменты получили название optoXRs (рис. 4), онипозволяют осуществить контроль над внутриклеточной сигнализацией дляизучения поведения свободно движущихся мышей [25].Рис.
4. Схематичное изображение работы optoXR [52].Скорость и точность, которые достигаются методами биохимическойоптогенетики, обеспечивают возможности, недостижимые для фармакологическихи генетических методов. Активное развитие этой области оптогенетики даетвозможность расширить применение этих технологий практически на все типыклеток.- 30 -1.8Выбор параметров светового пучка и доставка светаПосле того, как опсины начали экспрессироваться в интересующихнейронах, следующей задачей становится доставка светового пучка. Требования кпараметрам различаются в зависимости от поставленного эксперимента.Например, для изучения быстрых осцилляций в тонких срезах мозга прииспользовании нескольких опсинов in vitro необходимы другие параметры пучка,нежели для исследования эффектов длительной стимуляции определенных отделовмозга в животных in vivo [53].
Параметры фототоков, индуцированных в нейронахимпульсом света, зависят от многих факторов. К таковым относятся типэкспрессируемого опсина, длина волны, интенсивность, время облучения и дажесобытия, происходившие до момента облучения. Если не все молекулыканалородопсина вернулись в исходное состояние после предыдущего облучения,начальный ответ на импульс света окажется меньше. Параметры активацииразличных опсинов приведены в Таблице 2.Коэффициент поглощения фотонов данной длины волны пропорционаленпотоку света, который в свою очередь представляет собой количество фотонов вединице площади в единицу времени. При разработке системы доставки света дляактивации опсинов прежде всего необходимо учитывать данный параметр. Однаков эксперименте удобнее пользоваться другой величиной.
Плотность потока светаизмеряется в мВт/мм2 и определяется как произведение потока света на энергиюодного фотона. Для каналородопсина ChR2 дикого типа при стандартном уровнеэкспрессии и облучении с длиной волны 473 нм плотность потока света,необходимая для инициирования аксонного потенциала, составляет 1–5 мВт/мм2.Как отмечалось ранее, требования к пучку света отличаются для различныхоптогенетических экспериментов.
В случае оптогенетического ингибирования- 31 -необходим продолжительный пучок света, так долго, сколько необходимоингибирование, в то время как при бистабильном оптогенетическом контролетребуется короткий пучок света с большим поперечным сечением гораздо меньшейплотности потока (<0.01 мВт/мм2).Для экспериментов in vitro, когда образец ткани наблюдается подмикроскопом, наиболее подходящие источники света – галогеновые/ксеноновыелампы, светодиоды, лазеры – могут быть размещены прямо вдоль луча светамикроскопа.
Для некоторых экспериментов требуется импульсное облучение. Длясоздания кратковременных импульсов света можно использовать быстрые затворы(напр. Lambda DG-4) или непосредственно импульсные лазеры. Для исследованийin vivo в свободно двигающихся животных наиболее подходящими являютсяисточники с высокими значениями мощности (10–15 мВт на краю 100 мкмволокна). Для стимуляции коркового слоя мозга возможно также использоватьсветодиоды.Таблица 2Свойства и параметры опсиновChR1/2 химеры,ChETAДлина волныРежим контроля470 нмreinhardtiiChR2, ChR2(H134R),ОрганизмхозяинаChlamydomonasОпсины(максимумактивации)ДеполяризацияМодуляторные возможностиЭкспериментальныесистемыБыстрое включение/выключение,In vitro: культурылучше всего использовать для точнойдиссоциированныхактивации нейронов.
Замена H134Rнейроновдает больше фототоков по отношениюIn vivo: C. elegans, D.к диким типам ChR2. ChR1/ChR2melanogaster курицы,химеры и ChETA дают пики до 200 Гц.мыши, крысы, приматыChR2 (с точечными мутациями)фукциональныеопсины (SFO)ChR2 (C128A),ChR2 (C128S),ChR2 (C128T)Chlamydomonas reinhardtiiСтупенчато-характеризуются медленной или470 нмоптически переключаемой(включение)546 нм(выключениеДля C128A иC128S)деактивацией. Замены C128A и C128SДеполяризациядают наиболее длительную активациюи высокую светочувствительность,C128T сохраняет высокую временнуюточность активации. SFOs можновключать и выключать синими изелеными световыми импульсами.In vitro: культурыдиссоциированныхнейроновopto-α1ARopto-β2ARNatronomonas pharaonisSyntheticNpHR, eNpHRSyntheticVChR1Volvox carteri- 33 -Красное смещение спектра действия535 нм(максимумДеполяризацияактивации)по отношению к ChR2, следовательно,VChR1 может быть активированнезависимо от ChR2Активируемый светом насос для хлора.589 нм(максимумИспользуется для гиперполяризацииГиперполяризацияактивации)нейронов с высокой временнойточностью и устойчивого торможенияв течение нескольких минут.500 нм(максимумБиохимическийактивации)500 нм(максимумактивации)БиохимическийАктивируемый светом GPCR(через G-белок)Активируемый светом GPCR(через G-белок)In vitro: культурыдиссоциированныхнейроновIn vitro: культурыдиссоциированныхнейронов и тонкие срезымозга крысыIn vivo: C.
elegans имышиIn vitro: клеточная линияHEK 293TIn vivo: мышиIn vitro: клеточная линияHEK 293TIn vivo: мышиДля контроля более глубоких областей мозга необходимо использоватьтонкое оптоволокно. С использованием оптоволокна возможно создание такназываемых оптотродов – инструментов для одновременной регистрацииэлектрофизиологических параметров и оптического возбуждения опсинов. Длямышей, без ограничения их движения, можно использовать волокно толщиной до300 мкм, тогда как для крыс эта величина достигает 400 мкм.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
