Диссертация (1144318), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Как следствие – недостаточнаяэкспрессии,специфичность.Недостаточнаяточность2 недели для созданиястереотаксическоговведения.Некотороерекомбинантногоколичество клеточно-специфичных промотороввируса.характеризуется низким уровнем экспрессии.- 17 -Cre-зависимыесистемы экспрессииAAVСпецифичностьопределяетсявыбором линиитрансгенных мышейCre.3 недели после введениядля достижениянеобходимого уровняэкспрессии,3 недели для созданиярекомбинантноговируса.Совпадают с AAV1.3.1 Вирусные системыВ отличие от большинства генетических методов, вирусные векторы,основанные на лентивирусах и аденоассоциированных вирусах (AAV), не требуютиспользования трансгенных животных-моделей.
Подобные методы позволяютдостичь высокого уровня экспрессии генов опсинов и в грызунах, и в приматах впериод до нескольких месяцев. Векторы, основанные на лентивирусах иаденоассоциированных вирусах, используемые в экспериментах, обладаютследующими параметрами: >109 трансдуцирующих единиц для лентивирусов и>1012 геномных копий для AAV. В общем случае, экспрессия генов опсинов в мозгегрызунов достигает необходимого уровня спустя 3 недели после введения AAV и2 недели – после введения лентивируса. Для достижения стационарного уровняэкспрессии в дистальных частях аксонов может понадобиться уже более 6 недель.При выборе варианта доставки генетического материала по средством вируснойконструкции, например, аденоассоциированноговирусаважноправильновыбирать промотор и серотип1.
В статье [16] авторы проводили сравнение AAV сразличным серотипом (1, 2, 5, 8, 9). В результате, вирусная конструкция AAV2показала самую низкую эффективность, по сравнению с AAV других серотипов(рис. 2.). Авторы отметили также большую токсичность конструкций AAV,содержащих CMV, по отношению к остальным промоторам.
Было отмечено, чтопо сравнению с промотором SynI промотор CaMKII демонстрировал болеедиффузный характер, что предполагает однородную трансдукцию нейронов. Вдругих исследованиях [16,17] авторами была отмечена лучшая эффективностьAAV имеющих 5 и 9 серотипы. Таким образом, при выборе доставки генетическогоматериала по средством аденоассоциированных вирусов важно выбирать1антигенная характеристика вируса, установленная на основе взаимодействия с антителами- 19 -оптимальное сочетание между серотипом и промотором в зависимости от цели изадач исследования.Рис. 2.
Экспрессия GFP упакованного в капсиды AAV1, 2, 5, 8 и 9 введенных в коруголовного мозга примата. Конструкции AAV, содержали CMV, CaMKII и SynI промоторы [16].1.3.2 ЭлектропорацияДля достижения экспрессии в некоторые типах клеток можно использоватьметод электропорации in utero в определенные дни развития эмбриона. С помощьюэтого метода можно обеспечить адресную доставку гена в корковые слои II и III, внейроны стриатума и гиппокампа [18–20]. В отличие от вирусных методов, спомощью электропорации можно доставлять ДНК любого размера с большимипромотерными сегментами для достижения большей клеточной специфичности.Электропорация также позволяет внедрить большее количество копий гена.- 20 -1.3.3 Трансгенные мышиНеобходимую экспрессию генов опсинов можно достичь, используятрансгенные кассеты, несущие рекомбинантные промоторы, и трансгенныеконструкции, основанные на бактериальных искусственных хромосомах.
Былополучено несколько линий трансгенных мышей без изменений репродуктивныхсвойств и без заметных изменений в поведении, экспрессирующих ChR2 под Thy1 промотором [21,22].1.3.4 Cre-зависимые системы экспрессииХотя клеточно-специфичные промоторы эффективны для достижениянеобходимого уровня экспрессии в определенных типах нейронов, некоторыепромоторы обладают слабой транскрипционной активностью. С их помощьюневозможно достичь экспрессии, при которой опсины смогут эффективносоздавать потенциал действия. Для увеличения транскрипционной активностибыли созданы специальные Cre-зависимые AAV-векторы.
Такие векторы содержаттрансгенные кассеты, которые активируются только в присутствии Cre втрансгенных линиях животных. Таким образом, для увеличения экспрессии вопределенном типе клеток необходимо выбрать нужную линию мышей.1.4Современные достиженияЗа прошедшие годы с помощью новой технологии был проведен рядинтереснейших экспериментов. Разрабатываются новые опсины с цельюприменения оптогенетики в многообразных исследованиях на различныхорганизмах. В 2008 году, например, из водоросли Volvoxcarteri был выделенканалородопсин VChR1, который чувствителен к желтому, а не синему цвету [23].Таким образом, используя параллельно несколько типов каналородопсинов, можно- 21 -одновременно контролировать смешанные популяции клеток – одни командыбудут отдаваться желтым светом первому типу клеток, синим – второму.Генетически были также созданы так называемые “быстрые” и “медленные”опсины, которые позволяют осуществлять временной контроль над потенциаломдействия.
Первые из них способны создавать потенциал действия до 200 раз всекунду [24]. Уже существуют опсины, чувствительные к свету, частота которогонаходится на границе видимого и инфракрасного диапазонов. Свет с даннойчастотой проникает глубже внутрь ткани и легче фокусируется.Одной из самых интересных возможностей применения оптогенетическихметодов является контроль не только за электрическими явлениями в нейроне, нои за определенными биохимическими событиями.
Как известно, большоеколичество медицинских препаратов действует через взаимодействие с семействоммембранных рецепторов – GPCR. Эти рецепторы действуют по принципу передачисигнала от какого-либо соединения (лекарства) извне внутрь клетки, тем самымизменяя внутриклеточный сигналинг, например, уровень ионов кальция.
Еслидобавить светочувствительный домен от родопсина к GPCR, можно получитьрецепторы, чувствительные к зеленому свету. Такие рецепторы получили названиеoptoXR [25]. При доставке с помощью вируса однокомпонентного гена optoXR вмозг лабораторных животных удалось осуществить клеточно-специфичныйконтроль светом определенных биохимических путей передачи сигнала [25].Разработка новых оптоволоконных приборов позволила осуществить доставкусветового пучка в любую область мозга свободно двигающихся животных. Былатакже создана методика, позволяющая одновременно исследовать оптическоевозбуждение и регистрацию электрических импульсов. В настоящее времявозможно, например, напрямую измерять электрическую активность в нейронных- 22 -ансамблях, ответственных за моторную деятельность, одновременно контролируяих с помощью опсинов.Первыедвигающихсяоптогенетическиеживотных,былиисследования,направленывыполненныенанаисследованиясвободнонейронов,синтезирующих нейротрансмиттер гипокретин [26].
Эти клетки считаютсяответственными за одно из нарушений сна – нарколепсию. Именно в этих клеткахбыли обнаружены специфические типы электрической активности, которые всовокупности приводят к пробуждению. С помощью оптогенетики было такжепоказано, как допамин-синтезирующие нейроны отвечают за чувство радости [27].Одними из самых известных экспериментов с применением оптогенетикиявляются опыты по исследованию новейших методов лечения болезни Паркинсона[28,29]. Данная патология характеризуется нарушением передачи информации вsubstantia nigra parscompacta – в нейронах, ответственных за моторнуюдеятельность. Для лечения болезни Паркинсона с начала 90-х годов применяетсяглубокая стимуляция мозга.
При этой методике переменный электронный импульсподаетсявопределенныеотделымозгаспомощьюимплантируемыхинструментов. Тем не менее, потенциально эффективная стратегия лечения сильноограничена, так как электродами стимулируются отдельные клетки мозга невыборочно. Фундаментальное понимание данного метода лечения было полученос применением оптогенетики. При переключении различных типов нейронов улабораторныхмышей(моделей болезни Паркинсона)были обнаруженынеожиданные результаты.
Наибольший терапевтический эффект достигается нестимуляцией определенного вида клеток, а воздействием на активностьсоединительных аксонов.- 23 -1.5Быстрое возбуждение – каналородопсины (ChR)Рассмотрим основные стратегии, с помощью которых может достигатьсяоптический контроль с использованием опсинов.В некоторых случаях ген микробного родопсина, например ChR2 (рис.
3),встроенный в нейроны, может привести к светоиндуцированному фототоку.Рис. 3. Схематичное изображение ChR2, экспрессированного в клеточной мембране [30].В настоящее время в основном используются модифицированные виды опсинов. Вчастности,некоторыемлекопитающих,чтокодоныводорослейзначительноповысилобылизамененыэкспрессиюнаданныхкодоныгенов.Безусловно, изменение кодонов может привести к непредвиденным эффектам,когда наряду с повышенной экспрессией в нейронах млекопитающих наблюдаетсятакже снижение других функций или экспрессии в других типах клеток.
Например,внедрение аминокислотной замены H134R в ChR2 привело к увеличению фототокав два раза при длительной стимуляции, однако временная точность резко снизиласьна фоне уменьшения скорости закрытия каналов [31].- 24 -Возбуждение VChR1 [23] желтым светом (590 нм) не оказывает воздействиянаChR2(пикпоглощения470нм)идаетвозможностьустановитькомбинированный контроль возбуждения в естественных условиях. БольшинствоChR, изученных на сегодняшний день, характеризуются относительно низкойодноканальнойпроводимостьюиширокойкатионнойизбирательностью.Комбинированные методики, в том числе с использованием VChR1, даютвозможность получить различные характеристики клеточных фототоков.При изучении, к примеру, мутанта с аминокислотной заменой L132C [32]было установлено, что его активация приводит к незначительным фототокам Ca2+при физиологических концентрациях Ca2+, а увеличение концентрации Ca2+ вцитозоле в основном обусловлено активацией эндогенных потенциал-зависимыхкальциевых каналов из-за деполяризации мембраны нейронов [33].
Проводимостивторого и даже третьего порядка всегда должны быть учтены, особенно, когданаблюдается высокая проводимость Ca2+.Различные типы клеток или даже разные отделы одной и той же клетки могутвызывать, переносить или отвечать на повышенные концентрации Ca2+ по-разному.Последниеработыпомоделированию,вкоторыхответыклеткинафотостимуляцию были интегрированы с помощью модели нейрона ХоджкинаХаксли [34], могут быть расширены и дополнены проводимостями второгопорядка, а значит, появляется возможность точнее прогнозировать клеточныеответы в рамках различных способов фотостимуляции.Проводимость дикого типа ChR2 деактивируется, начиная с 10 мс послепрекращения фотостимуляции, в то время как мутантный ChR2 (C128X) (заменыцистеина-128 и аспартата-156) деактивируется гораздо медленнее [35,36].Например, варианты белков с заменами C128T, C128A и C128S характеризуются- 25 -постоянной времени соответственно 2с, 42с, 100с [35].
Прекращение этогостабильного, вызванного голубым светом фототока возможно путем примененияимпульсов желтого света (560-590 нм). Опсины этого класса называют ступенчатофукциональными опсинами (SFO), так как они делают возможным ступенчатыйконтроль мембранного потенциала, что вероятнее приведет к порогу потенциаладействия и увеличит вероятность эндогенных синаптических выходов [35].Два ключевых различия между SFO и ChR:1)Увеличениеклеточнойсветочувствительности,котораяявляетсярезультатом накопления открытых каналов в течение светового импульса [35,37].2) Асинхронная природа SFO-опосредованной активности нейронов, котораяне вовлекает все экспрессирующие нейроны в единый блок событий, вызванныйфотостимуляцией.Сейчас существуют SFO с постоянным временем деактивации до 30 мин [38],что дает возможность приблизить экспрессирующие нейроны к стабильномупотенциалу покоя, с последующим удалением источника света и началаповеденческого или физиологического эксперимента при полном отсутствии светаилидругогооборудования.низкоинтенсивныхБолееимпульсовсветатого,даетиспользованиедлительныхвозможностьустранениянеравномерности ответа экспрессирующих клеток, в данном случае даже большиеобъемы ткани могут быть доведены до уровня насыщения с течением времени.Но, несмотря на то, что SFO дает широкие экспериментальные возможности,егоиспользованиевсегдадолжносопровождатьсядополнительнымиэлектрофизиологическим исследованиями.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
