Диссертация (1144318), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Определены зависимости между активностью гиппокампальныхмышиных пирамидных нейронов, экспрессирующих светочувствительный (длинаволнывозбуждения470нм)каналородопсин-2,ипараметрамисветовойстимуляции при многократном воздействии. В работе впервые установлено, что:- 10 -1.Частотаследованиясветовогоимпульса,вызывающаястабильнуюгенерацию потенциалов действия у нейронов гиппокампа в культуре,находится в диапазоне от 1 Гц до 5 Гц.2.Зависимость величины амплитуды мембранного тока нейронов гиппокампа,экспрессирующих каналородопсин-2, от длительности светового стимулапри многократно повторяющихся воздействиях является нелинейной.3.Величинаамплитудыэкспрессирующихмембранногоканалородопсин-2,токанейроноввозрастаетпригиппокампа,увеличенииинтенсивности светового стимула в ходе многократно повторяющегосявоздействия.4.Время, необходимое для достижения максимума амплитуды мембранноготока (τ), при увеличении длительности светового стимула изменяетсянелинейно.5.Электрофизиологическая активность пирамидальных нейронов гиппокампапри выбранных рабочих параметрах светового стимула у трансгеннойлинии PS1-M146V knock-in (KI) модели БА отличается от контрольнойлинии при светоиндуцированной активации.6.Определенные в предварительных экспериментах параметры световогостимула позволяют генерировать потенциал действия в эксперименте сбиологической обратной связью.Научно-практические значение работыПолученные результаты позволяют более глубоко понять работу системысветозависимых ионных каналов ChR2, а также подобрать условия для стабильнойактивации нейронов, экспрессирующих каналородопсины-2, в ходе многократной- 11 -световой стимуляции.
Это даёт возможность оптимизировать проведениеоптогенетических экспериментов с учетом минимального нагрева тканей, а такжерегулировать минимальный и максимальный клеточный ответ при световойстимуляции в экспериментах in vitro и в перспективе in vivo, например, при оценкесинаптических связей между нейронами коры и стриатума при болезниХантингтона или при исследовании механизмов памяти [12] и др.Апробация работыРезультатыдиссертационнойработыпредставленынаследующихконференциях: 3-й международной школе-конференции «Saint-Petersburg OPEN2018» по Оптоэлектронике, Фотонике, Нано- и Нанобиотехнологиям (СанктПетербург, 2016); «Volga Neuroscience Meeting 2016» (Санкт-Петербург –Нижний-Новгород, 2016); Конференции с международным участием XLV«НЕДЕЛЯ НАУКИ СПбПУ» (Санкт-Петербург, 2016); на 4-й международнойшколе-конференции «Saint-Petersburg OPEN 2017 по Оптоэлектронике, Фотонике,Нано-иНанобиотехнологиям»(Санкт-Петербург,2017);нейрофоруме«Возможности для развития НейроНет на глобальном рынке» (Санкт-Петербург,2017); Конференции с международным участием XLVI «НЕДЕЛЯ НАУКИСПбПУ» (Санкт-Петербург, 2017); Всероссийской конференции с международнымучастием «Оптогенетика и оптофармакология» (Санкт-Петербург, 2018); «FENSForum 2018» (Берлин, 2018).Основные результаты по теме диссертационного исследования опубликованыв 16 научных работах.
Из них 8 статей в изданиях, входящих в перечень ВАК, где3 статьи опубликованы по материалам конференций и 8 статей в изданиях, невошедших в перечень ВАК, из них 6 по материалам конференций.- 12 -Объем и структура диссертацииДиссертационная работа состоит из введения, 3 глав, выводов, указателялитературы и приложений. Глава 1 - обзор литературы - представляет собой анализданных литературы о том, что такое оптогенетика, основные ее направления,каким образом можно доставить генетическую информацию, кодирующую опсиныв специфических нейронах объекта исследования, а также о ее современномположении и тонкостях применения.
Глава 2 посвящена описанию материалов иметодов, используемых в данном исследовании. Глава 3 представляет изложениесобственных результатов о зависимости активности пирамидных нейроновгиппокампа, экспрессирующих каналородопсин-2, от параметров световойстимуляции, применении выбранных параметров на основе определенных ранеезависимостей для исследования активности нейронов гиппокампа мышей дикоготипа и мышей-моделей БА, а также обсуждение полученных результатов. В концеглавы 3 приводятся данные о применении выбранных параметров световойстимуляции в экспериментах с биологической обратной связью.
Текст диссертацииизложен на 91 странице, содержит 6 таблиц, иллюстрирован 34 рисунками. Списоклитературы содержит 68 источников, из них отечественных – 2, зарубежных – 66.- 13 -Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ1.1История появления оптогенетикиВ 1979 первооткрыватель структуры ДНК Фрэнсис Крик высказалпредположение, что одной из главных задач в области нейронаук являетсяизбирательный контроль одного типа клеток в мозге при условии, что остальныеклетки будут оставаться нетронутыми [13].
Так как электродами невозможновозбудить определенную область с необходимой точностью, а различныелекарства действуют слишком медленно, то Крик предположил, что видимый светобладает всеми свойствами, чтобы использовать его в качестве инструментаконтроля. Однако в то время не было никаких методов, чтобы сделатьопределенные клетки чувствительными к свету.Положение изменилось с открытием опсинов – специфического классасветочувствительных ионных каналов (рис. 1).Рис. 1.
Типы опсинов. Channelrhodopsins (ChR) - светоактивируемый катионный канал.Halorhodopsins (HR) и бактериородопсины (BR) светоактивируемый хлорный канал и протоннаяпомпа. OptoXRs – опсины, связанные с G -белками, которые влияют на внутриклеточныйсигналинг [14].В 1971 Стокениус и Остерхельт установили, что бактериородопсин являетсяионным насосом, который может быть быстро активирован фотонами видимогосвета [15]. Позднее были найдены и другие представители этого семейства -- 14 -галородопсин (1977) и каналородопсин (2002) [6]. Опсины – специфический класссветочувствительных ионных каналов.Тем не менее, долгое время считалось, что подобное объединениеоптических и генетических методов не даст желаемого эффекта.
Во-первых, попричине того, что чужеродные мембранные белки, встроенные в клетку, могутбыть токсичными. С другой стороны, считалось, что индуцированные светом токибудут слишком малы. К тому же бактериальным опсинам для поглощения фотоновнеобходим еще и химический кофактор – полностью-трансретиналь (all-transретиналь).Летом 2005 была опубликована работа, в которой была продемонстрированавозможность использования бактериального опсина без добавления каких-либодругих частей, компонентов или реагентов [8].
При этом нейроны становилисьчувствительными к свету. В следующие несколько лет в других работах былопоказано, что, как и каналородопсин, бактериородопсин и галородопсин такжеспособны включать или выключать нейроны быстро и безопасно для клеток в ответна облучение светом различного спектра.Ткани позвоночных уже содержатполностью-трансретиналь, и таким образом оптогенетический контроль возможенв интактных тканях мозга и даже в свободно передвигающихся животных.1.2ОптогенетикаОптогенетика – методика, основанная на внедрении в клеточную мембранусветочувствительных ионных каналов, реагирующих на возбуждение светомопределенной длиной волны.Оптогенетика позволяет контролировать с помощью света электрическуюактивность определённого вида нейронов, клеточный сигналинг и другиепроцессы.- 15 -1.3Генетические методы доставки генов опсинов в специфичныепопуляции нейроновГены опсинов могут селективно экспрессироваться в определенном,выбранном заранее типе нейронов в мозге.
Для этого необходимо использоватьследующие генетические методы доставки:1. Трансгенные технологии2. Лентивирусы3. Аденоассоциированные вирусы4. Cre-зависимые системы экспрессии AAVРассмотрим основные стратегии, эффективность которых была доказана длядостижения экспрессии in vivo (Таблица 1).Таблица 1Генетические методы доставки генов опсиновМетодТипы клетокТрансгенныетехнологииЛюбой тип клетокпри использованиимолекулярныхмаркеровЛентивирусыКлеточноспецифичныепромоторы. CaMKIIα– глутаматергическиенейроны, GFAP –астроциты,гипокретинсекретирующиенейроны.Аденоассоциированные вирусыКлеточноспецифичныепромоторы.SynapsinI – нейронспецифичный,ppSST- SST-нейроныВремяСвойстваОт 6 месяцев до годаМожно добиться высокой специфичности,используя бактериальные специфичныехромосомы.Легко достигается высокий уровень экспрессии.Экспрессиясохраняетсянескольколет.2 недели после введенияНевозможно использовать большие фрагментыдля достиженияпромоторов.
Как следствие – недостаточнаянеобходимого уровняспецифичность.Недостаточнаяточностьэкспрессии,стереотаксическоговведения.Некоторое2 недели для созданияколичество клеточно-специфичных промотороврекомбинантногохарактеризуется низким уровнем экспрессии. Ввируса.настоящее время используется почти во всехэкспериментальных животных-млекопитающих.Легко достигается высокий уровень экспрессии.3 недели после введенияЭкспрессиясохраняетсянескольколет.для достиженияНевозможно использовать большие фрагментынеобходимого уровняпромоторов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
