Диссертация (1144318)

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла

-2-ОГЛАВЛЕНИЕСПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ....................................................................................... 4ВВЕДЕНИЕ ................................................................................................................. 5ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ ............................ 8АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ .........................................................................................

11ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ........................................................................ 131.1ИСТОРИЯ ПОЯВЛЕНИЯ ОПТОГЕНЕТИКИ ........................................................... 131.2ОПТОГЕНЕТИКА .............................................................................................. 141.3ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДОСТАВКИ ГЕНОВ ОПСИНОВ В СПЕЦИФИЧНЫЕПОПУЛЯЦИИ НЕЙРОНОВ ............................................................................................ 151.3.1 ВИРУСНЫЕ СИСТЕМЫ .....................................................................................

181.3.2 ЭЛЕКТРОПОРАЦИЯ .......................................................................................... 191.3.3 ТРАНСГЕННЫЕ МЫШИ..................................................................................... 201.3.4 CRE-ЗАВИСИМЫЕ СИСТЕМЫ ЭКСПРЕССИИ....................................................... 201.4СОВРЕМЕННЫЕ ДОСТИЖЕНИЯ .........................................................................

201.5БЫСТРОЕ ВОЗБУЖДЕНИЕ – КАНАЛОРОДОПСИНЫ (CHR) .................................. 231.6БЫСТРОЕ ИНГИБИРОВАНИЕ– ГАЛОРОДОПСИНЫ (NPHR) ................................. 271.7ИНСТРУМЕНТЫ ДЛЯ МОДУЛЯЦИИ БИОХИМИЧЕСКОГО СИГНАЛИНГА ............... 281.8ВЫБОР ПАРАМЕТРОВ СВЕТОВОГО ПУЧКА И ДОСТАВКА СВЕТА .........................

30ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ............................. 352.1ЛИНИИ МЫШЕЙ .............................................................................................. 352.2ПЕРВИЧНАЯ КУЛЬТУРА ГИППОКАМПА............................................................. 362.3КАЛЬЦИЙ-ФОСФАТНАЯ ТРАНСФЕКЦИЯ ........................................................... 382.4МЕТОД ЛОКАЛЬНОЙ ФИКСАЦИИ ПОТЕНЦИАЛА................................................ 38-3-2.5ОПТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ МЕТОД .......................................................................... 392.6МЕТОДЫ СТАТИСТИЧЕСКОЙ ОБРАБОТКИ .........................................................

41ГЛАВА 3. ПАРАМЕТРЫ СВЕТОВОЙ СТИМУЛЯЦИИ .................................. 433.1ЗАВИСИМОСТЬМЕЖДУ ЧАСТОТОЙ СВЕТОВОГО СТИМУЛА И ГЕНЕРАЦИЕЙПОТЕНЦИАЛОВ ДЕЙСТВИЯ......................................................................................... 433.2ЗАВИСИМОСТЬАМПЛИТУДЫМЕМБРАННОГОТОКАОТДЛИТЕЛЬНОСТИСВЕТОВОГО СТИМУЛА...............................................................................................

443.3ЗАВИСИМОСТЬАМПЛИТУДЫМЕМБРАННОГОТОКАОТИНТЕНСИВНОСТИСВЕТОВОГО СТИМУЛА............................................................................................... 503.4.ВРЕМЯ ДОСТИЖЕНИЯ МАКСИМУМА АМПЛИТУДЫ (Τ) ...................................... 523.5.СРАВНЕНИЕАКТИВНОСТИ ПИРАМИДНЫХ НЕЙРОНОВ ГИППОКАМПА МЫШЕЙ,ЭКСПРЕССИРУЮЩИХКАНАЛОРОДОПСИН-2,ДИКОГОТИПАИМЫШЕЙ-МОДЕЛИБОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА ........................................................................................... 563.6.ГЕНЕРАЦИЯСВЕТОИНДУЦИРОВАННЫХПОТЕНЦИАЛОВДЕЙСТВИЯВЭКСПЕРИМЕНТАХ С БИОЛОГИЧЕСКОЙ ОБРАТНОЙ СВЯЗЬЮ ......................................... 65ЗАКЛЮЧЕНИЕ ..........................................................................................................

67РЕЗУЛЬТАТЫ ДИСЕРТАЦИОННОГО ИССЛЕДОВАНИЯ .................................. 68ВЫВОДЫ ................................................................................................................... 69СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ .......................................................................................... 70ПРИЛОЖЕНИЕ 1 .......................................................................................................

77ПРИЛОЖЕНИЕ 2 ....................................................................................................... 80ПРИЛОЖЕНИЕ 3 ....................................................................................................... 82-4-СПИСОК СОКРАЩЕНИЙБАБолезнь АльцгеймераПДПотенциал действияChR2Каналородопсин-2NpHRГалородопсиныSFOСтупенчато-функциональные опсины-5-ВВЕДЕНИЕАктуальность работыГоловной мозг состоит из различных областей и типов нейронов,формирующих нейронные связи и типы активности. Возрастное и генетическоенарушение связей между нейронами может приводить к возникновениюнейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, Паркинсона,Хантингтона и др. В связи с ростом среднего возраста населения во всем мире,связанногосновымидостижениямимедициныитехники,проблеманейродегенеративных заболеваний становится актуальной для современногообщества.

Поэтому на передний план выдвигаются задачи поиска причин,механизмов и возможных путей восстановления нарушенных типов нейроннойактивности.Традиционнодляизучения механизмов активности нервной тканииспользуют стимуляцию электрическим током через электрод, помещенный вовнеклеточное пространство. Несмотря на то, что этот метод позволяет легкоконтролировать временное разрешение, в большинстве случаев многие нейроны вэлектрическом поле стимулируются одновременно. Существенным недостаткомэлектрическойстимуляцииявляетсястимуляции нейронов определенноготакжетипа,невозможностьпосколькуизбирательнойони имеют свойспецифический характер активности [1–3].

Альтернативным вариантом являетсявнутриклеточная стимуляция, которая имеет необходимое пространственное ивременное разрешение. Однако применение такого метода обычно ограниченокультурами клеток или срезами.Таким образом, одной из основных проблем при изучении активностинейронов является трудность стимулирования специфической группы нейронов,-6-особенно in vivo. Эту проблему удалось решить, когда появились оптогенетика сметодами оптической стимуляции нейронов.

В последнее время методыоптическойстимуляциипривлекаютпристальноевниманиеиз-затакихпреимуществ по сравнению с обычными методами стимуляции, как: высокоепространственноеивременноеразрешение,параллельнаястимуляция(возбуждение или угнетение) определенных участков головного мозга [4,5].Оптогенетика – биофизический метод исследования работы нервных клеток,основанный на генетической модификации клеточной мембраны, целью которойявляется внедрение в мембрану нервных клеток специальных ионных каналов –опсинов, реагирующих на световые воздействия определенной длины волны.Одним из представителей семейства опсинов, который наиболее широкоприменяетсявпрактике,являетсяканалородопсин-2(ChR2).Этотсветочувствительный белок выделен из глазного пятна зеленой водорослиChlamydomonas reinhardtii [6,7]. Активация каналородопсинов-2 происходит привозбуждении синим светом с максимумом возбуждения 470 нм, что в свою очередьвызывает мгновенные фоторецепторные токи из-за неселективного прохождения вцитоплазму клетки катионов (Na+, K+, Ca2+, H+) [7].

В 2005 году былапродемонстрирована быстрая фотостимуляция генетически модифицированныхнейронов, содержащих ChR2 [8].Каналородопсины-2 достаточно часто используется в экспериментах наотдельных участках головного мозга, например, на гиппокампе для изучениямеханизмов нарушения памяти, связанного с повреждением пирамидальныхнейронов при нейродегенеративных заболеваниях, таких как болезнь Альцгеймера[9] и Хантингтона [10,11]-7-Для неселективного прохождения катионов через каналы ChR2 обычноприменяется световая стимуляция с параметрами, аналогичными внеклеточной ивнутриклеточной электрической стимуляции.

В некоторых случаях такой подходможет быть оправдан, например, когда применяется однократная световаястимуляция, т.к. в этом случае вклад в суммарную нейрональную активность засчет ионов, поступающих в клетку через систему каналов ChR2, будетодинаковым. Однако при многократном световом воздействии ситуация можеткардинально измениться, например, из-за десенсибилизации [7] части каналов придлительной световой стимуляции. С точки зрения биофизики важно понимать, каксовокупность экспрессированных в клеточной мембране каналородопсинов-2будет изменять активность нейрона в ответ на изменение параметров световойстимуляции.Так как активность нейронов, экспрессирующих ChR2, может изменятьсяпри различных параметрах световой стимуляции (длительность, частота,интенсивность), актуальной задачей становится определение зависимостей междуактивностью нейронаи параметрами световогостимула, особеннопримногократном воздействии.Цель и задачи исследованияЦелью диссертационного исследования явилось определение параметровсветового стимула, при которых электрофизиологический ответ пирамидальныхнейронов гиппокампа в культуре, экспрессирующих каналородопсин-2, в ходедлительного воздействия будет стабильным.Для достижения указанной цели были поставлены и последовательно решеныследующие задачи:-8-1.Настройкаэкспериментальногосоответствующихпротоколовоборудованиядляпроведенияиразработкаоптогенетическихисследований.2.Освоение оптогенетического метода на первичной культуре нейроновгиппокампа мышей.3.Определение частоты светового стимула, при которой будут генерироватьсяпотенциалы действия на протяжении всего периода стимуляции.4.Определение зависимости амплитуды мембранного тока от длительности иинтенсивности светового стимула.5.Определение зависимости времени достижения максимума амплитудымембранного тока (τ) от длительности светового стимула.6.Выбор рабочих параметров светового стимула на основе полученныхзависимостей.7.Применение полученных параметров светового стимула в эксперименте.Основные положения выносимые на защитуНа защиту выносятся следующие положения:1.Частотаследованиясветовогоимпульса,вызывающаястабильнуюгенерацию потенциалов действия у нейронов гиппокампа в культуре,находится в диапазоне от 1 Гц до 5 Гц.2.Зависимость величины амплитуды мембранного тока нейронов гиппокампа,экспрессирующих каналородопсин-2, от длительности светового стимулапри многократно повторяющихся воздействиях является нелинейной.3.Величинаамплитудыэкспрессирующихмембранногоканалородопсин-2,токанейроноввозрастаетпригиппокампа,увеличении-9-интенсивности светового стимула в ходе многократно повторяющегосявоздействия.4.Время, необходимое для достижения максимума амплитуды мембранноготока (τ), при увеличении длительности светового стимула изменяетсянелинейно.5.Электрофизиологическая активность пирамидальных нейронов гиппокампапри выбранных рабочих параметрах светового стимула у трансгенной линииPS1-M146V knock-in (KI) модели БА отличается от контрольной линии присветоиндуцированной активации.6.Определенные в предварительных экспериментах параметры световогостимула позволяют генерировать потенциал действия в эксперименте сбиологической обратной связью.Научная новизна работыНаучная новизна диссертационного исследования определяется тем, что внем представлены результаты, полученные при помощи поставленного иапробированного автором диссертации современного метода исследования работынервныхклеток –оптогенетики.Впервыеисследованаработасистемысветочувствительных каналов в динамике в режиме длительной световойстимуляции.

Характеристики

Тип файла PDF

PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.

Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.

Список файлов диссертации