Автореферат (1144316), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Известно, что стабилизацияпроцесса поддержания внутриклеточной концентрации ионов Ca2+ имеет важное значение длясохранения жизнеспособности нейронов и является основным компонентом синаптическойпередачи [Berridge, 1998]. Использование светочувствительных ионных каналов (опсинов) можетоткрыть путь к пониманию механизмов, вызывающих различные патологии и нарушения,например, при БА.Для сравнения активности нейронов контрольной и мутантной группы оптогенетическимметодом были выбраны следующие параметры световой стимуляции: длительность световогостимула – 10 мс, частота – 1 Гц, интенсивность – Imax.
В режиме фиксации тока в конфигурации«целая клетка» осуществлялось измерение потенциалов на мембране пирамидных нейроновгиппокампа мышей дикого типа и мышей-модели БА в ответ на световой стимул с заданнымипараметрами (Рис. 8).Рис. 8. Активность нейронов гиппокампа мышей, экспрессирующих ChR2, дикого типа и мышей-моделиБА при возбуждении синим светом (470 нм, t = 10 мс, T = 1 Гц, I = Imax), зарегистрированная в режимефиксации тока, конфигурация «целая-клетка».13При сравнение светоиндуцированных ПД у здоровых клеток и клеток с патологией БА небыло обнаружено достоверных отличий при многократной световой стимуляции в подобранныхусловиях. По этой причине длительность светового стимула была увеличена и выбрана поаналогии с электростимуляцией (Рис.
9) [Zhang и др., 2015].Рис. 9. Активность нейронов гиппокампа мышей, экспрессирующих ChR2, дикого типа и мышеймодели БА, A – в ответ на инъекцию током (50 пА, t = 1 с) [Zhang и др., 2015], Б – при возбуждениисиним светом (470 нм, t = 500 мс, T = 1 Гц, I = Imax).Далее были проведены аналогичные измерения со следующими параметрами световогостимула: t = 500 мс, T = 1 Гц, I = Imax. Результаты представлены на рисунке 17.Рис. 10.
(А) Активность нейронов гиппокампа мышей дикого типа и мышей-модели БА привозбуждении синим светом (470 нм, t = 500 мс, T = 1 Гц, I = Imax), зарегистрированная в режимефиксации тока, конфигурация «целая-клетка». (Б) – Активность нейронов гиппокампа мышей дикоготипа и мышей-модели БА в ответ на первый световой стимул.Полученные результаты (рис. 11) показали изменение амплитуды и количества ПД унейронов гиппокампа мышей дикого типа и мышей-модели БА. Количествосветоиндуцированных ПД у клеток с патологией на протяжении всего периода световойстимуляции было достоверно больше, чем у контрольной группы клеток. При этом значение14амплитуды ПД у патологических клеток было достоверно меньше, чем у нейронов контрольнойгруппы.Рис.
11. Динамика изменения амплитуды ПД (A, Б) и их количества (В, Г) у нейронов гиппокампамышей дикого типа и мышей модели БА при световой стимуляции.Разницу в активности нейронов гиппокампа при световой стимуляции между нейронамиконтрольной группы и нейронами с патологией БА можно объяснить разным начальнымпотенциалом на мембране, который может быть связан с нарушением кальциевого обмена умышей-моделей БА. У нейронов с патологией БА мембранный потенциал всегда был смещен вположительную область, а значит, нейроны были более возбудимы. На рис.
12 нагляднопродемонстрирована разница в генерации потенциалов действия у здоровых нейронов инейронов с патологией БА, экспрессирующих каналородопсин-2.Таким образом, следует отметить, что наряду с выявленными ранее отличиями вактивности нейронов дикого типа и БА, с помощью химической активации путем ингибированияГАМК-рецепторов, электрической стимуляции [Zhang и др., 2015], оптическая стимуляция иоптогенетические инструменты позволили выявить новые отличия. Молекулярно-клеточныемеханизмы этого явления могут служить предметом для дальнейших исследований какфундаментального, так и прикладного характера.15Рис.
12. Генерация потенциалов действия, индуцированная синим светом (470 нм, t = 500 мс, F =1 Гц, I = Imax), записанная в режиме фиксации тока, конфигурация «целая клетка» для нейронов дикоготипа (сверху) и нейронов мышей-моделей БА (снизу). Значения мембранных потенциалов указаны безучета погрешности liquid junction potentia11.ГЕНЕРАЦИЯ СВЕТОИНДУЦИРОВАННЫХ ПОТЕНЦИАЛОВ ДЕЙСТВИЯ ВЭКСПЕРИМЕНТАХ С БИОЛОГИЧЕСКОЙ ОБРАТНОЙ СВЯЗЬЮБиологическая обратная связь представляет комплекс из электрофизиологическогооборудования и специализированного компьютерного программного обеспечения. Цель этойсистемы – отслеживать активность нейрона(ов), в момент обнаружения заданной в программеактивности, например, определенной формы ПД в виде иктального разряда (характернойнейронной активности, предшествующей эпилептическим разрядам в головном мозге), подаватьсветовой стимул на целевую группу нейронов, экспрессирующих опсин(ы), например,каналородопсины-2.1Потенциал жидкого перехода, возникает, когда два раствора электролитов разной концентрацииконтактируют друг с другом.16Рис.
13. Биологическая обратная связь с нейроном в первичной культуре гиппокампа (инициациявторого ПД после световой стимуляции t = 20 мс, F = 1 Гц, I = Imax), а – спонтанно возникший потенциалдействия нейрона в отсутствие световой стимуляции; б – дублет, имитированный системой обратнойсвязи, он же в увеличенном масштабе приведен на графике (г). На графиках а, б и г сверху приведенадинамика мембранного потенциала во времени, а снизу – динамика света длиной волны 470 нм,включаемого в режиме обратной связи; в – фотография флуоресцирующего нейрона.В данном исследовании на основе определенных ранее зависимостей были определеныпараметры светового стимула, при которых система отслеживала спонтанно генерируемыйпотенциал действия, после чего осуществляла световую стимуляцию (t = 20 мс, F = 1 Гц, I = Imax),вызывающую генерация следующего ПД (рис.
13). Полученные результаты позволят вдальнейшем использовать подобранные и апробированные параметры световой стимуляции вэкспериментах на животных эпилептической модели для подавления интериктальных разрядов(подобных эпилептическим разрядам в головном мозге).ЗАКЛЮЧЕНИЕВ настоящем исследовании оценено влияние длительности, частоты и интенсивностисветового воздействия на активность нейронов гиппокампа in vitro с экзогенной экспрессиейсветочувствительных каналов ChR2. На основе полученных данных проведено такжеоптогенетическое сравнение электрофизиологической активности нейронов гиппокампа в нормеи при патологии. Подобраны необходимые и достаточные параметры световой стимуляции вэкспериментах с биологической обратной связью.Определен интервал длительностей светового импульса – 10-30 мс, при котором значениеамплитуды мембранного тока достигает максимума.
Показано, что при увеличенииинтенсивности светового стимула увеличивается значение амплитуды мембранного тока.В результате оптогенетического сравнения активности нейронов гиппокампа линии дикого типаи трансгенной линии PS1-M146V knock-in (KI) модели БА выявлены различия в количестве17светоиндуцированных потенциалов действия в начальный момент и с течением времени. Присветовой стимуляции нейронов мышей-моделей БА с нарушением внутриклеточной кальциевойсигнализации наблюдается увеличение числа ПД и уменьшение их амплитуды во времясветового воздействия по отношению к контрольным нейронам мышей дикого типа.В экспериментах с биологической обратной связью путем подбора необходимыхпараметров (t = 20 мс, F = 1 Гц, I = Imax) светового стимула удалось добиться стабильнойсветоиндуцированной генерации ПД.ВЫВОДЫ1.2.3.4.5.6.Частота следования светового импульса 1 Гц вызывает стабильную генерацию потенциаловдействия у нейронов гиппокампа в культуре.Зависимость величины амплитуды мембранного тока нейронов гиппокампа,экспрессирующих каналородопсин-2, от длительности светового стимула (t) примногократно повторяющихся воздействиях имеет нелинейный характер с максимумом вдиапазоне длительностей 10-30 мс.Величина амплитуды мембранного тока нейронов гиппокампа, экспрессирующихканалородопсин-2, возрастает при увеличении интенсивности светового стимула в ходемногократно повторяющегося воздействия.Значение времени достижения максимума амплитуды (τ) возрастает при увеличениидлительности светового стимула (t) до t = 50 мс, после чего зависимость τ(t) выходит наплато.Нейроны гиппокампа трансгенной линии PS1-M146V knock-in (KI) модели БА,экспрессирующие каналородопсин-2, генерирует статистически большее количество ПД сменьшей амплитудой по сравнению с контрольной группой нейронов гиппокампа мышейдикого типа.При длительности светового стимула 20 мс, частоте 1 Гц и максимальной интенсивностигенерируется потенциал действия в эксперименте с биологической обратной связью.Рекомендации и перспективы дальнейшей разработки темы исследования.Исследованная в данной работе динамика мембранных токов и потенциалов ChR2,экспрессированных в мембране нейронов гиппокампа мыши, позволит оптимизироватьпроведение оптогенетических экспериментов с учетом минимального нагрева тканей, а такжерегулировать минимальный и максимальный клеточный ответ при световой стимуляции.Примененный комплекс методов может быть использован для изучения другихсветочувствительных ионных каналов.СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИПубликации в изданиях, рецензируемых ВАК1.2.Ерофеев, А.И., Матвеев, М.В., Терехин, С.Г., Захарова, О.А., Плотникова, П.В., Власова,О.Л.
Оптогенетика – новый метод исследования нейрональной активности // Научнотехнические ведомости СПбГПУ. Физико-математические науки. 2015. №3(225). С. 61–74.Матвеев, М.В., Ерофеев, А.И., Терехин, С.Г., Плотникова, П.В., Воробьев, К.В., Власова,О.Л. Имплантируемые устройства для оптогенетических исследований и стимуляции183.4.5.6.7.8.возбудимых тканей // Научно-технические ведомости СПбГПУ. Физико-математическиенауки. 2015. №3(225). C. 75–85.Erofeev, A.I., Zakharova, O.A., Matveev, M.V., Terekhin, S.G., Bezprozvanny, I.B., Vlasova,O.L. Use of optogenetic technology in cell culture models // Journal of Physics: Conference Series.2016. V.741(1). P. 1–4.Matveev, M.V., Erofeev, A.I., Zakharova, O.A., Pyatyshev, E.N., Kazakin, A.N., Bezprozvanny,I.B., Vlasova, O.L.
Implantable optical-electrode device for stimulation of spinal motoneurons //Journal of Physics: Conference Series. 2016. V.741(1). P. 1–4.Ерофеев, А.И., Захарова, О.А., Терехин, С.Г., Плотникова, П.В., Безпрозванный, И.Б.,Власова, О.Л. Оптогенетическое исследование электрофизиологических особенностейнейронов гиппокампа трансгенных мышей линии PS1-M146V (модель болезниАльцгеймера) // Журнал высшей нервной деятельности им. И.П.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
