Автореферат (1144316), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Это даёт возможность оптимизировать проведениеоптогенетических экспериментов с учетом минимального нагрева тканей, а также регулироватьминимальный и максимальный клеточный ответ при световой стимуляции в экспериментах invitro и в перспективе in vivo, например, при оценке синаптических связей между нейронами корыи стриатума при болезни Хантингтона или при исследовании механизмов памяти [Vann, Xiong,2016] и др.Методология и методы исследования. В экспериментальной части диссертацииприменялись современные методы, адекватные поставленным задачам исследования. Дляработы с пирамидными нейронами использовался метод получения первичнойдиссоциированной культуры гиппокампа мышей.
Доставка генов, кодирующихсветочувствительный ионный канал – канолородопсин-2, осуществлялась методом кальцийфосфатной ко-трансфекции. Для измерения активности нейронов под действием световойстимуляции, экспрессирующих каналородопсин-2, применялся метод локальной фиксациипотенциала «path-clamp» в конфигурации «целая-клетка». Основным методом данногоисследования была оптогенетика, а основным подходом было биофизическое исследованиесветочувствительных ионных каналов – каналородопсинов-2, экспрессированных в мембраненейронов гиппокампа мыши.
Все вышеописанные методики являются современными иадекватными подходами в области молекулярной и клеточной биологии.1.2.3.4.5.6.Положения, выносимые на защиту. На защиту выносятся следующие положения:Частота следования светового импульса, вызывающая стабильную генерацию потенциаловдействия у нейронов гиппокампа в культуре, находится в диапазоне от 1 Гц до 5 Гц.Зависимость величины амплитуды мембранного тока нейронов гиппокампа,экспрессирующих каналородопсин-2, от длительности светового стимула при многократноповторяющихся воздействиях является нелинейной.Величина амплитуды мембранного тока нейронов гиппокампа, экспрессирующихканалородопсин-2, возрастает при увеличении интенсивности светового стимула в ходемногократно повторяющегося воздействия.Время, необходимое для достижения максимума амплитуды мембранного тока (τ), приувеличении длительности светового стимула изменяется нелинейно.Электрофизиологическая активность пирамидальных нейронов гиппокампа привыбранных рабочих параметрах светового стимула у трансгенной линии PS1-M146V knockin (KI) модели БА отличается от контрольной линии при светоиндуцированной активации.Определенные в предварительных экспериментах параметры светового стимула позволяютгенерировать потенциал действия в эксперименте с биологической обратной связью.5Степень достоверности и апробация результатов.
Достоверность полученныхрезультатов обусловлена соответствием используемых методов поставленным задачам,воспроизводимостью результатов и применению методов статистического анализа.Основные результаты по теме диссертационной работы опубликованы в виде 17 научныхработ, в том числе 8 статей из них 3 по материалам конференций в изданиях, входящих в переченьВАК, а также 9 статей из них 7 по материалам конференций в изданиях, не вошедших в переченьВАК. Результаты исследования докладывались на 9-и научных конференциях.Объем и структура диссертации.
Диссертационная работа изложена на 91 листемашинописного текста, включает 34 рисунка и 6 таблиц. Работа состоит из введения, обзоралитературы, экспериментальной части, включающей методологическую часть и результатыисследования, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов и списка литературы.Список литературы содержит 68 источников литературы на русском и английском языке.Диссертация соответствует общим требованиям к оформлению кандидатских и докторскихдиссертаций, утвержденных ГОСТ Р 7.0.11-2011.Личный вклад автора. Результаты диссертационной работы получены лично автором набазе Лаборатории Молекулярной нейродегенерации (ЛМН) Санкт-ПетербургскогоПолитехнического университета Петра Великого, возглавляемой д.б.н.
И.Б. Безпрозванным.Планирование экспериментов и обсуждение полученных результатов проводилось совместно снаучными руководителями: д.ф.-м.н. О.Л. Власовой. Автор принимал непосредственное участиев выполнении представленных в работе экспериментов.
Налаживание оптогенетического методав лаборатории осуществлялось совместно с сотрудниками лаборатории ЛМН О.А. Захаровой иС.Г. Терехиным, помощь в наборе статистических данных осуществлялась студентами Г.А.Арзамасцевым и Е.И. Герасимовым. Обработка данных, подготовка результатов к публикациямпроводилась лично автором, тексты публикаций подготавливались совместно с соавторами.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫВ работе исследована динамика фототоков каналродопсинов-2, экспрессированных вмембране пирамидных нейронов гиппокампа в культуре.в зависимости от частоты,длительности и интенсивности светодиодного источника. Объектом экспериментальногоисследования были пирамидные нейроны гиппокампа в первичной культуре, экспрессирующиеChR2. В работе применялись следующие методы: культивирование диссоциированныхнейронов гиппокампа мышей, выделение плазмидной ДНК, кальций-фосфатная ко-трансфекция,метод локальной фиксации потенциала (patch-clamp), оптогенетический метод, методыстатистической обработки.Линии мышей.
Все эксперименты, использованные в этом диссертационномисследовании, были одобрены комиссией по уходу и использованию лабораторных животныхФГБУ НИИ гриппа имени А.А. Смородинцева Министерства Здравоохранения РоссийскойФедерации. В работе использовались следующие линии мышей: Рапполово (Россия), PS1-M146Vknock-in и дикий тип мышей B6 (C57BL / 6 J, № 000664), полученные из «The Jackson Laboratory»(США). Уход и содержание экспериментальных животных были стандартными исоответствовали всем необходимым требованиям.
Животных содержали в виварии,расположенном в Лаборатории молекулярной нейродегенерации в Санкт-Петербургскомполитехническом университете Петра Великого. Уход и содержание животных осуществляли в6контролируемых условиях: 4-5 особей в клетке, 12-часовой период освещения, комнатнаятемпература 20±2°С, влажность 50-70%.Первичная культура гиппокампа. Для выделения первичной диссоциированнойкультуры нейронов гиппокампа мышей использовались новорожденные мышата в возрасте додвух дней. Получение первичной культуры осуществляли по протоколу, описанному в статье[Chen и др., 2011]. Рост культуры осуществляли в инкубаторе с 5% содержанием СО2 притемпературе +37оС в 24-луночном планшете на стеклах диаметром 12 мм.
Стеклапредварительно отмывали по 30 минут в ацетоне, в 100% и 70% этаноле, затем высушивали ипокрывали поли-D-лизином (Sigma, #27964) в концентрации 0,1 мг/мл и инкубировали в течение3 часов при температуре +37оС или при +4оС в течение 16 часов. При избыточном ростеглиальных клеток культуру обрабатывали ингибитором пролиферации Ara-C (цитозин β-Dарабинофуранозид) (Sigma, #C1768) в конечной концентрации 40 мкМ на 3-й денькультивирования (DIV).
На 7-й DIV проводили кальций-фосфатную трансфекцию. На 14-й DIVв каждую лунку добавлялось по 0,5 мл свежей среды (Neurobasal А, 0,5 мМ L-глутамин, 2% B27).Кальций-фосфатная трансфекция. Введение плазмиды FCK-ChR2-GFP (Addgene,#15814) в нейроны гиппокампа in vitro осуществляли методом кальций-фосфатной трансфекции.Данную процедура проводили на 7-й день после получения первичной культуры при помощинабора (Clontech Laboratories Inc., #631312,) по протоколу производителя с рекомендациями,согласно статье [Jiang, Chen, 2006] .
По причине того, что длина возбуждения (470нм)флуоресцентной метки (GFP) совпадает с длиной возбуждения каналородопсина-2, использоваливторую маркерную плазмида pCSCMV:tdTomato (Addgene, #30530), кодирующая красныйфлуоресцентный белок с длиной волны возбуждения 530 нм. Для введения двух плазмидиспользовали метод кальций-фосфатной ко-трансфекции. Для этого плазмиды смешивались всоотношении 3:1, где 3 части составляла плазмида интереса, т.е. FCK-ChR2-GFP.Метод локальной фиксации потенциала (patch-clamp). Регистрацию активностинейронов в первичной культуре гиппокампа мышей проводили в режиме фиксации потенциалаи тока в конфигурации «целая-клетка» на 14-16 день после выделения первичной культурыгиппокампа. Для проведения экспериментов использовали омывающий раствор искусственнойспинномозговой жидкости (ACSF) следующего состава: NaCl (124 мM), KCl (5 мM), NaHCO3 (26мM), NaH2PO4 (1 мM), CaCl2 (2,5 мM), MgCl2 (1,3 мM), glucose (10 мM), pH 7,4; 290-310 мОсм.Поиск нейронов осуществляли на микроскопе Olympus IX73 в связке с 4-диодным источникомсвета и управляющим устройством Thorlabs DC4104.
Для записи активности нейронов,экспрессирующих каналородопсины-2, отбирали пирамидные нейроны гиппокампа,флуоресцирующие при возбуждении зеленым (530 нм) и синим светом (470 нм). После выбораклетки с помощью микроманипулятора Siskiyou MX7600L к ней подводили стеклянныймикроэлектрод, заполненный следующим раствором: K-глюканат (140 мM), MgCl2 (2 мM), NaCl(2 мM), ATP-Na (2 мM), GTP-Mg (0.3 мM), HEPES (10 мM), pH 7,35; 290-310 мОсм. В моментначала образования плотного контакта клетку фиксировали с потенциалом -70 мВ.Микроэлектрод изготавливали на пуллере Sutter Instrument P-1000 из боросиликатного стекла снаружным диаметром 1,5 мм и внутренним диаметром 0,86 мм (Sutter Instrument) ссопротивлением 3-5 МОм.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
