Автореферат (1144316)
Текст из файла
На правах рукописиЕРОФЕЕВАлександр ИгоревичДИНАМИКА МЕМБРАННЫХ ТОКОВ И ПОТЕНЦИАЛОВ,ИНДУЦИРОВАННЫХ СВЕТОМ В ПИРАМИДАЛЬНЫХ НЕЙРОНАХГИППОКАМПА МЫШИ03.01.02 — БиофизикаАВТОРЕФЕРАТдиссертации на соискание ученой степеникандидата физико-математических наукСанкт-Петербург – 2018Работа выполнена в лаборатории молекулярной нейродегенерации ФГАОУ ВО «СанктПетербургский политехнический университет Петра Великого», г. Санкт-Петербург.Научный руководитель:доктор физико-математических наук, доцентВласова Ольга Леонардовна,и.о.
директора Института биомедицинских систем и технологийзаведующий кафедрой медицинской физики, ФГАОУ ВО«Санкт-Петербургский политехнический университетПетра Великого»Официальные оппоненты:доктор биологических наук, профессорЗоя Иринарховна Крутецкая,заведующий кафедрой биофизики биологическогофакультета ФГАОУ ВО «Санкт-ПетербургскийГосударственный университет» (г. Санкт-Петербург)доктор физико-математических наук, профессорЮрий Михайлович Романовскийпрофессор кафедры общей физики и волновых процессовФГБОУ ВО «Московский государственный университетИмени М.В. Ломоносова» (г. Москва)Ведущая организация:ФГБУН «Институт физиологии им. И.П.
Павлова» РАН(г. Санкт-Петербург)Защита состоится «26» декабря 2018 г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д212.229.25 при Федеральном государственном автономном образовательном учреждениивысшего образования «Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого» поадресу: 194021, г. Санкт-Петербург, ул. Хлопина 11, корп. 1, кафедра «Медицинская физика».С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ФГАОУ ВО «СПбПУ» и насайте www.spbstu.ru.Автореферат разослан «____» ____________________2018 г.Ученый секретарьдиссертационного совета Д 212.229.25доктор биологических наук, доцентЛинькова Н.С.2ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫАктуальность темы исследования.
Традиционно для изучения механизмов активностинервной ткани используют электрическую стимуляцию электродами, помещенными вовнеклеточное пространство [Han и др., 2014; Jacobs и др., 2016]. Несмотря на то, что этот методпозволяет легко контролировать временное разрешение, в большинстве случаев многие нейроныв электрическом поле подвергаются одновременному воздействию. По этой причинеисключается возможность стимуляции нейронов определенного типа, которым свойственен свойспецифический характер активности [Hutcheon, Yarom, 2000; Somogyi, Klausberger, 2005].Альтернативным вариантом является внутриклеточная стимуляция, которая имеет необходимоепространственное и временное разрешение.
Однако применение такого метода обычноограничено нейронами в культуре или в срезах.В 2005 году появилась одна из основных публикаций, которая представила новый метод,позволивший решить проблемы внутриклеточной и электрической стимуляции электродами[Boyden и др., 2005]. Этот метод получил название оптогенетика – биофизический методисследования работы нервных клеток, основанный на генетической модификации клеточноймембраны, целью которой является внедрение в мембрану нервных клеток специальных ионныхканалов — опсинов, реагирующих на световые воздействия определенной длины волны. Однимиз представителей семейства опсинов является каналродопсин-2 (ChR2), который не селективнозакачивает в цитоплазму катионы (Na+, K+, Ca2+, H+) при возбуждении светом длиной волны 470нм.
Каналородопсины-2 достаточно часто используется в экспериментах на отдельных участкахголовного мозга, например, на гиппокампе для изучения механизмов нарушения памятисвязанных с повреждением пирамидальных нейронов при нейродегенеративных заболеваниях,таких как болезнь Альцгеймера [Liu и др., 2012] и Хантингтона [Hodges, Salmon, Butters, 1990;Ramirez, Tonegawa, Liu, 2014].Для неселективного прохождения катионов через каналы ChR2 обычно применяетсясветовая стимуляция с параметрами аналогичными внеклеточной и внутриклеточнойэлектрической стимуляции.
В некоторых случаях такой подход может быть оправдан, например,когда применяется однократная световая стимуляция, т.к. в этом случае вклад в суммарнуюнейрональную активность за счет ионов, поступающих в клетку через систему каналов ChR2,будет одинаковым. Однако при многократном световом воздействии ситуация можеткардинально измениться, например, из-за десенсибилизации [Nagel и др., 2003] части каналовпри длительной световой стимуляции.
С точки зрения биофизики важно понимать, каксовокупность экспрессированных в клеточной мембране каналродопсинов-2 будет изменятьактивность нейрона в ответ на изменение параметров световой стимуляции.Так как активность нейронов, экспрессирующих ChR2, может изменяться при различныхпараметрах световой стимуляции (длительность, частота, интенсивность), актуальной задачейстановится определение зависимостей между активностью нейрона и параметрами световогостимула, особенно при многократном воздействии.Степень разработанности темы исследования. Светочувствительные ионные каналы, вчастности, каналродопсин-2, являются перспективным инструментом модуляции нейроннойактивности.В настоящее время они широко используются в нейробиологическихисследованиях, а также имеют перспективы использования для лечения и профилактикинейродегенеративных заболеваний. Использование светочувствительных ионных каналов вэкспериментах in vitro и ex vivo, как правило предполагает кратковременную световуюстимуляцю, что предотвращает нагрев тканей и позволяет точно контролировать “клеточный3ответ”.
Однако в in vivo экспериментах ситуация складывается иначе. Например, в экспериментахпо исследованию уровня Аb амилоидов у мышей-модели болезни Альцгеймера авторыосуществляли хроническую световую стимуляцию [Yamamoto и др., 2015], что, вероятнее всегоприводило к нагреву тканей и непредсказуемому клеточному ответу в случае использованияChR2.Работа опсинов, в частности ChR2, напрямую зависит от светового стимула [Nagel и др.,2003].
В работах [Nagel и др., 2003; Nikolic и др., 2009] было показано изменение активностиклеток при разных параметрах светового стимула. Однако не было охарактеризовано какменяется активность этих клеток в ходе многократной световой стимуляции.Данное исследование, проведенное с использованием современных методов, позволилоустановить зависимости между электрофизиологическим ответом нейрона гиппокампа мыши,экспрессирующего каналродопсины-2 и параметрами стимуляции в ходе многократногосветового воздействия.
Тем самым дополнив существующие знания о кинетических свойствахChR2.Цель и задачи исследования. Цель исследования заключается в определении параметровсветового стимула, при которых активность пирамидного нейрона гиппокампа,экспрессирующего каналродопсины-2, в ходе многократной световой стимуляции будетстабильна.Для достижения указанной цели были поставлены и последовательно решены следующиезадачи:1. Настройка экспериментального оборудования и разработка соответствующих протоколовдля проведения оптогенетических исследований.2. Освоение оптогенетического метода на первичной культуре нейронов гиппокампа мышей.3. Определение частоты светового стимула, при которой будут генерироваться потенциалыдействия на протяжении всего периода стимуляции.4. Определение зависимости амплитуды мембранного тока от длительности и интенсивностисветового стимула.5.
Определение зависимости времени достижения максимума амплитуды мембранного тока(τ) от длительности светового стимула.6. Выбор рабочих параметров светового стимула на основе полученных ранее зависимостей.7. Применение полученных ранее параметров светового стимула в эксперименте.Научная новизна. Научная новизна диссертационной работы определяется тем, что в нейпредставлены результаты, полученные при помощи поставленного и апробированного авторомработы современного метода исследования активности нервных клеток – оптогенетики.
Впервыеисследована работа системы светочувствительных каналов в динамике в режиме длительнойсветовой стимуляции. Определены зависимости между активностью пирамидных нейроновгиппокампа мыши, экспрессирующих светочувствительный (длина волны возбуждения 470нм)каналородопсины-2, и параметрами световой стимуляции при многократном воздействии. Вработе впервые:1. Определены зависимости между активностью пирамидного нейрона в первичной культуре,экспрессирующего каналродопсины-2 и параметрами светового стимула при многократномсветовом воздействии.2.
Показано, что при коротких (1-5мс) и длительных (100-500мс) световых импульсах примногократном световом воздействии наблюдается статистически значимое уменьшение4значения амплитуды мембранного тока между первым стимулом и последующими унейронов в первичной культуре гиппокампа, экспрессирующих каналродопсин-2.3. Проведено сравнение электрофизиологической активности нейронов мышей дикого типа(C57BL/6J) и мышей-модели болезни Альцгеймера (PS1-M146V) в первичной культуреоптогенетическим методом.Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты позволяютболее глубоко понять работу системы светозависимых ионных каналов ChR2, а также подобратьусловия для стабильной активации нейронов, экспрессирующих каналродопсины-2, в ходемногократной световой стимуляции.
Характеристики
Тип файла PDF
PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.
Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
