Автореферат (1144316), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Запись активности пирамидных нейронов осуществлялась в режимефиксации тока и потенциала в конфигурации «целая-клетка».7Активность нейрона регистрировали в программе pCLAMP 10.7 (Molecular Devices) спомощью усилителя MultiClamp 700B (Molecular Devices) и цифрового преобразователя Digidata1440A (Molecular Devices).Оптогенетический метод. На 14 день после получения первичной культуры гиппокампа,т.е. через 7 дней после кальций-фосфатной ко-трансфекции осуществляли запись активностинейронов. Во время измерения активности нейронов гиппокампа, экспрессирующих ChR2 (рис.1, слева), осуществляли световую стимуляцию синим светодиодом (λ = 470 нм, Imax= 35 мВ·мм-2,φmax = 250 мВ).
Максимальное значение интенсивности было принято за единицу, всепоследующие значения интенсивностей рассчитывали, как процент от максимального значенияи обозначали как «относительная интенсивность». Для описания динамики мембранныхфототоков и потенциалов было проведено 10 измерений (рис. 1, справа) при каждойдлительности светового импульса 1-5 мс, 10-50 мс и 100-500 мс для разных интенсивностей.Рис. 1. Пирамидальный нейрон, экспрессирующий ChR2, во время записи фоторецепторных токовметодом локальной фиксации потенциала (слева). Фототоки пирамидального нейрона,экспрессирующего ChR2, зарегистрированные в режиме фиксации потенциала в конфигурации «целаяклетка» во время световой стимуляции: t = 100 мс, I = Imax, F = 1 Гц (справа).РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕДля записи активности нейронов, экспрессирующих каналродопсин-2 отбиралисьпирамидные нейроны гиппокампа, флуоресцирующие при возбуждении зеленым (530нм) исиним светом (470нм).
Запись активности пирамидных нейронов осуществлялась в режимефиксации тока и потенциала в конфигурации «целая-клетка». Световая стимуляцияосуществлялась синим светодиодом (λ = 470нм, Imax = 35 мВ·мм-2, φ = 250 мВ).ЗАВИСИМОСТЬ МЕЖДУ ЧАСТОТОЙ СВЕТОВОГО СТИМУЛА И ГЕНЕРАЦИЕЙПОТЕНЦИАЛОВ ДЕЙСТВИЯЗависимость между активностью пирамидного нейрона гиппокампа, экспрессирующегоChR2 и параметрами светового стимула определялась в экспериментах, в которых примногократной световой стимуляции, подбиралась частота, при которой генерировалисьпотенциалы действия (ПД) (рис. 2).
Рассматривалась именно генерация ПД, т.к. изменениемембранных токов в ответ на световые стимулы происходило при любой заданной частоте.8Рис. 2. Генерация потенциалов действия пирамидного нейрона гиппокампа, экспрессирующегоканалродопсин-2 при разных значениях частоты светового стимула(t = 20 мс, Imax)Согласно полученным результатам выбрано значение частоты равное 1 Гц. Все дальнейшиеизмерения проводились с этой частотой. Полученные результаты схожи с данными,опубликованными в статье [Ishizuka и др., 2006], однако начиная со значения частоты 5 Гц ивыше наблюдались расхождения в количестве генерируемых светозависимых ПД, что можетбыть объяснено разным уровнем экспрессии ChR2 [Ishizuka и др., 2006].ЗАВИСИМОСТЬ АМПЛИТУДЫ МЕМБРАННОГО ТОКА ОТ ДЛИТЕЛЬНОСТИСВЕТОВОГО СТИМУЛАНа следующем этапе работы оценивалось влияние длительности светового стимула (1-5 мс,10-50 мс, 100-500 мс) на амплитуду мембранных токов при разных интенсивностях (рис.3).АБРис.3.
Зависимость амплитуды мембранного тока А – нейронов, Б – нейрона гиппокампа отдлительности светового стимула при разных интенсивностях света(максимальное значение Imax= 35 мВ·мм-2 принималось за 1, n = 10).Кривая зависимости значения амплитуды мембранного тока от длительности световогостимула имеет максимум в диапазоне длительностей от 10 до 30мс с последующим спадом.Схожая зависимость наблюдалась для всех рассматриваемых интенсивностей.
Падение значенияамплитуды мембранного тока при больших длительностях светового стимула (100-500мс) вслучае многократного светового воздействия может быть обусловлено десенсибилизацией частиканалродопсинов-2, экспрессированных в клеточной мембране нейрона.9Для обобщения полученных результатов и их дальнейшего использования на практикепостроена диаграмма, в которой по оси абсцисс отмечали длительность светового стимула, пооси ординат отмечали разницу между амплитудами мембранных токов первого и второго ответовна световой стимул.
(Рис. 4).Рис. 4. Диаграмма, отображающая зависимость между разницей амплитуд мембранного тока дляпервого и второго стимулов (∆) и длительностью светового импульса при разных интенсивностяхсветового потока.Наименьший разброс между значениями амплитуд мембранных токов первого и второгоответов на световой стимул приходится на промежуток длительностей светового стимула 10-30мс. При увеличении длительности светового стимула разница между значениями амплитудмембранных токов увеличивается, т.е. чем дольше происходит световая многократнаястимуляция, тем меньше становится значение амплитуды фототоков.
Объяснением такойзависимости может быть инактивация части каналородопсинов-2 при длительной световойстимуляции [Nagel и др., 2003].Впервые объяснение этого факта для одного канала было предложено в работе [Nagel и др.,2003], где рассматривалась модель фотоцикла ChR2, состоящая из трех состояний: открытого(O), десенсибилизированного (D) и закрытого (C). Однако после спектрального исследованияканалородопсина-2 [Bamann и др., 2010], результаты которого указали на существование четырехкинетических состояний P1, P2, P3 и P4, были предложены другие модели, описывающие кинетикуChR2: модель четырех [Hegemann, Ehlenbeck, Gradmann, 2005; Nikolic и др., 2009] и шести[Grossman и др., 2013] состояний.
В качестве основной модели для объяснения полученных вдиссертационной работе результатов была использована модель четырех состояний. В этоймодели выделялись два открытых состояния (O1 → O2) и два закрытых (C1 → C2), при этомсостояние O2 обладало меньшей проводимостью, а состояние C2 длилось порядка секунд, чтоможет объяснить потерю чувствительности части каналородопсинов-2 при длительных световыхстимуляциях. Состояния, определенные в спектральном анализе канала, можноинтерпретировать следующим образом O1 → O2 соответствуют состояниям P2 и P3 (открытыесостояния с постоянной времени 1 мс и 10 мс соответственно), состояние C2 (постоянная времени5 с) соответствует состоянию P4 (десенсибилизированное). Состояние C1 является основнымсостоянием канала и соответствует P0 [Nikolic и др., 2009]. Вероятно, при больших длительностях10светового стимула начинает преобладать состояние P4, которое переводит канал вдесенсибилизированное состояние, что объясняет полученные результаты (Рис.
3, 4).ЗАВИСИМОСТЬ АМПЛИТУДЫ МЕМБРАННОГО ТОКА ОТИНТЕНСИВНОСТИ СВЕТОВОГО СТИМУЛАДалее определялась зависимость между значениями амплитуды мембранного токапирамидного нейрона гиппокампа мыши, экспрессирующего ChR2 и интенсивностью световогостимула. Полученные результаты демонстрировали близкую к линейной зависимость на всемдиапазоне длительностей светового стимула 1-5 мс, 10-50 мс, 100-500 мс (рис. 5). Приувеличении интенсивности светового потока увеличивалось значение амплитуды мембранноготока пирамидного нейрона, экспрессирующего ChR2.Рис.
5. Зависимость амплитуды мембранного тока от интенсивности светового стимула приразных длительностях светового импульса 1-5 мс (сверху), 10-50 мс (в центре), 100-500 мс (снизу).Таким образом, можно сделать вывод о том, что максимальное значение амплитудымембранного тока, вызванного световым воздействием, достигается при максимальнойинтенсивности в диапазоне длительностей светового стимула 10-30 мс. Все выявленныезависимости согласуется с опубликованными ранее для ChR2 [Nagel и др., 2003; Nikolic и др.,2009].11ВРЕМЯ ДОСТИЖЕНИЯ МАКСИМУМА АМПЛИТУДЫ (τ)Представленныеранеезависимостихарактеризуютизменениеамплитудысветоиндуцированных токов в зависимости от выбранных параметров светового стимула. Однимиз важных параметров наравне, с амплитудой фототоков, который необходимо учитывать привыборе параметров световой стимуляции, является время (τ).
Под τ понимается временнойинтервал между началом световой стимуляции и моментом достижения максимального значенияамплитуды мембранного тока. На рисунке 6 изображены фоторецепторные токи,зарегистрированные при разных длительностях светового стимула (1-5 мс, 10-50 мс, 100-500 мс)на которых отчетливо прослеживается изменение параметра τ в зависимости от длительностисветового стимула.Рис. 6. Светоиндуцированные мембранные токи, зарегистрированные при (F = 1 Гц, I = Imax) разныхдлительностях светового импульса 1-5 мс (слева), 10-50 мс (по центру), 100-500 мс (справа), полученныев режиме фиксации потенциала конфигурации «целая-клетка».Полученные результаты показали, что при увеличении длительности светового стимулаувеличивается τ, однако это происходит до t = 50 мс включительно, после чего криваязависимости τ(t) выходит на плато (Рис.
7).Рис. 7. Фототоки зарегистрированные в режиме фиксации потенциала конфигурации целая клетка придлительности светового стимула t = 100 мс, T = 1 Гц, I = Imax (слева), зависимость времени τ отдлительности светового стимула (справа).Вид зависимости τ(t), вероятно, можно объяснить тем, что множество ChR2 каналовсинхронизуются между собой, и время этой синхронизации в среднем занимает 50 мс.Подтверждением этого факта может служить значение амплитуды первого ответа нейрона при12световом возбуждении, который всегда имеет самое большое значение, по сравнению состальными значениями амплитуд.
Т.е. сначала система ChR2 каналов открываетсяодномоментно, что дает максимальный поток ионов через мембрану, после чего часть каналовнаходится в десенсибилизированном состоянии, а часть каналов в активном. После чегочередование этих состояний входит в некоторое синхронизованное состояние, что объясняетсявыходом зависимости τ(t) на плато.СРАВНЕНИЕ АКТИВНОСТИ ПИРАМИДНЫХ НЕЙРОНОВ ГИППОКАМПА МЫШЕЙ,ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ КАНАЛОРОДОПСИН-2, ДИКОГО ТИПА И МЫШЕЙ-МОДЕЛИБОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРАНа основе полученных зависимостей выбраны параметры светового стимула, необходимыедля сравнения активности нейронов гиппокампа мышей дикого типа и мышей-модели болезниАльцгеймера (БА).
Выбор трансгенной линии был обусловлен тем, что у мышей-модели БА(экспрессирующих мутантный белок пресенелин-1), несмотря на отсутствие амилоидныхотложений в мозгу, ученые обнаружили возникновение дефектов памяти, начиная с 3–4месячного возраста [Sun и др., 2005; Wang и др., 2004], а также аномалии в активности нейронов,обусловленные нарушением внутриклеточной кальциевой сигнализации. «Кальциевая» гипотезасвязана с нарушением регуляции концентрации ионов Ca2+ в эндоплазматическом ретикулуме(ЭР), преимущественно в случае, когда в этот процесс вовлечены мутантные варианты белковпресенилинов [Bezprozvanny, Mattson, 2008; Stutzmann, 2007].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
